Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode vor, um komplexe Proteinnetzwerke in Vesikel einzubauen, an denen integrale Membranproteine, Enzyme und fluoreszenzbasierte Sensoren unter Verwendung gereinigter Komponenten beteiligt sind. Diese Methode ist relevant für das Design und den Bau von Bioreaktoren und die Untersuchung komplexer metabolischer Reaktionsnetzwerke außerhalb des Gleichgewichts. Wir beginnen mit der Rekonstitution von (mehreren) Membranproteinen zu großen unilamellären Vesikeln (LUVs) nach einem zuvor entwickelten Protokoll. Anschließend verkapseln wir ein Gemisch aus gereinigten Enzymen, Metaboliten und fluoreszenzbasierten Sensoren (fluoreszierende Proteine oder Farbstoffe) mittels Gefrier-Auftau-Extrusion und entfernen nicht eingebaute Komponenten durch Zentrifugation und/oder Größenausschlusschromatographie. Die Leistung der Stoffwechselnetzwerke wird in Echtzeit gemessen, indem das ATP/ADP-Verhältnis, die Metabolitenkonzentration, der interne pH-Wert oder andere Parameter durch Fluoreszenzauslesung überwacht werden. Unsere Membranprotein-haltigen Vesikel mit einem Durchmesser von 100-400 nm können mit bestehenden, aber optimierten Verfahren in riesig-unilamelläre Vesikel (GUVs) umgewandelt werden. Der Ansatz ermöglicht den Einbau löslicher Komponenten (Enzyme, Metaboliten, Sensoren) in mikrometergroße Vesikel, wodurch das Volumen der Bioreaktoren um Größenordnungen vergrößert wird. Das metabolische Netzwerk, das GUVs enthält, wird in mikrofluidischen Geräten gefangen, um sie mit optischer Mikroskopie zu analysieren.

Einleitung

Der Bereich der synthetischen Biologie von unten konzentriert sich auf die Konstruktion von (minimalen) Zellen ^1,2 und metabolischen Bioreaktoren für biotechnologische ^3,4 oder biomedizinische Zwecke ^5,6,7,8. Die Konstruktion synthetischer Zellen bietet eine einzigartige Plattform, die es Forschern ermöglicht, (Membran-)Proteine unter genau definierten Bedingungen zu untersuchen, die denen der natürlichen Umgebung nachahmen

Protokoll

1. Allgemeine Vorbereitung

1. Chemikalien
   1. Lösen Sie Lipide (in Pulverform) auf 25 mg/ml in CHCl₃ auf, um vorgeformte Liposomen herzustellen.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frische Lipide herzustellen, aber die Stammlösungen können auch einige Wochen bei -20 °C gelagert werden. Die Arbeit mit Lipiden in Pulverform ist genauer als die Verwendung von Lipiden, die bereits in CHCl₃ solubilisiert sind. CHCl₃ sollte mit Glaspipetten und/oder Spritzen gehandhabt und in Glasbehältern aufbewahrt werden, da CHCl₃ Kunststoffe auflöst.
   2. Kleine Moleküle (Nukleotide, Aminosäuren, Fluoreszenzsonden)....

Diskussion

Wir stellen ein Protokoll für die Synthese von (Membran-)Proteinen vor, die submikrometergroße Lipidvesikel (proteoLUVs) enthalten, und die Umwandlung von proteoLUVs in riesen-unilamelläre Vesikel (proteoGUVs). Das Protokoll sollte anwendbar sein für die Rekonstitution anderer Membranproteine^{13, 19, 30, 40} und die Verkapselung anderer Stoffwechselnetzwerke als der hier vorgestellten L-Argin.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g