Construction de réseaux métaboliques hors équilibre dans des vésicules de taille nanométrique et micrométrique

Résumé

Nous présentons un protocole pour reconstituer les protéines membranaires et encapsuler des enzymes et d’autres composants solubles dans l’eau dans des vésicules lipidiques de taille submicrométrique et micrométrique.

Résumé

Nous présentons une méthode pour incorporer dans les vésicules des réseaux de protéines complexes, impliquant des protéines membranaires intégrales, des enzymes et des capteurs basés sur la fluorescence, en utilisant des composants purifiés. Cette méthode est pertinente pour la conception et la construction de bioréacteurs et l’étude de réseaux de réactions métaboliques complexes hors équilibre. Nous commençons par reconstituer des protéines membranaires (multiples) en grandes vésicules unilamellaires (LUV) selon un protocole préalablement développé. Nous encapsulons ensuite un mélange d’enzymes purifiées, de métabolites et de capteurs basés sur la fluorescence (protéines fluorescentes ou colorants) par congélation-décongélation-extrusion et éliminons les composants non incorporés par centrifugation et/ou chromatographie d’exclusion stérique. La performance des réseaux métaboliques est mesurée en temps réel en surveillant le rapport ATP/ADP, la concentration en métabolites, le pH interne ou d’autres paramètres par lecture de fluorescence. Nos vésicules contenant des protéines membranaires de 100 à 400 nm de diamètre peuvent être converties en vésicules unilamellaires géantes (GUV), en utilisant des procédures existantes mais optimisées. L’approche permet d’inclure des composants solubles (enzymes, métabolites, capteurs) dans des vésicules de taille micrométrique, augmentant ainsi le volume des bioréacteurs de plusieurs ordres de grandeur. Le réseau métabolique contenant les GUVs est piégé dans des dispositifs microfluidiques pour être analysé par microscopie optique.

Introduction

Le domaine de la biologie synthétique ascendante se concentre sur la construction de cellules (minimales) ^1,2 et de bioréacteurs métaboliques à des fins biotechnologiques ^3,4 ou biomédicales 5,6,7,8. La construction de cellules synthétiques fournit une plate-forme unique qui permet aux chercheurs d’étudier les protéines (membranaires) dans des conditions bien définies imitant celles des environnements natifs, permett....

Protocole

1. Préparation générale

1. Produits chimiques
   1. Dissoudre les lipides (sous forme de poudre) à 25 mg/mL dans CHCl₃ pour la fabrication de liposomes préformés.
      REMARQUE : Il est préférable de préparer des stocks de lipides frais, mais les solutions mères peuvent également être conservées à -20 °C pendant quelques semaines. Travailler avec des lipides sous forme de poudre est plus précis que d’utiliser des lipides déjà solubilisés dans CHCl₃. Le CHCl₃ doit être manipulé à l’aide de pipettes et/ou de seringues en verre et stocké dans des récipients en verre, car le CHCl₃ dissout les plastiques.

Discussion

Nous présentons un protocole pour la synthèse de protéines (membranaires) contenant des vésicules lipidiques de taille submicrométrique (proteoLUVs), et la conversion de proteoLUVs en vésicules géantes-unilamellaires (proteoGUVs). Le protocole devrait être applicable à la reconstitution d’autres protéines membranaires 13,19,30,40 et à l’encapsulation de réseaux métaboliques autres que les voies de dégradation de la L-arginine et de synthèse du glycérol 3-phosphate présentées .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g