Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

Resumen

Presentamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas y otros componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico y micrométrico.

Resumen

Presentamos un método para incorporar a las vesículas redes complejas de proteínas, que involucran proteínas de membrana integrales, enzimas y sensores basados en fluorescencia, utilizando componentes purificados. Este método es relevante para el diseño y construcción de biorreactores y el estudio de redes complejas de reacciones metabólicas fuera de equilibrio. Comenzamos reconstituyendo (múltiples) proteínas de membrana en grandes vesículas unilaminares (LUVs) de acuerdo con un protocolo previamente desarrollado. A continuación, encapsulamos una mezcla de enzimas purificadas, metabolitos y sensores basados en fluorescencia (proteínas fluorescentes o colorantes) mediante congelación-descongelación-extrusión y eliminamos los componentes no incorporados mediante centrifugación y/o cromatografía de exclusión por tamaño. El rendimiento de las redes metabólicas se mide en tiempo real mediante el seguimiento de la relación ATP/ADP, la concentración de metabolitos, el pH interno u otros parámetros mediante la lectura de fluorescencia. Nuestras vesículas que contienen proteínas de membrana de 100-400 nm de diámetro se pueden convertir en vesículas unilaminares gigantes (GUV), utilizando procedimientos existentes pero optimizados. El enfoque permite la inclusión de componentes solubles (enzimas, metabolitos, sensores) en vesículas de tamaño micrométrico, aumentando así el volumen de los biorreactores en órdenes de magnitud. La red metabólica que contiene los GUV queda atrapada en dispositivos microfluídicos para su análisis mediante microscopía óptica.

Introducción

El campo de la biología sintética ascendente se centra en la construcción de células (mínimas) ^1,2 y biorreactores metabólicos con fines biotecnológicos ^3,4 o biomédicos ^5,6,7,8. La construcción de células sintéticas proporciona una plataforma única que permite a los investigadores estudiar proteínas (de membrana) en condiciones bien definidas que imitan las de los entornos nativos, lo que permite el descubrimiento d....

Protocolo

1. Preparación general

1. Productos químicos
   1. Disuelva los lípidos (en forma de polvo) a 25 mg/mL en CHCl₃ para hacer liposomas preformados.
      NOTA: Es preferible preparar caldos lipídicos frescos, pero las soluciones madre también pueden almacenarse a -20 °C durante algunas semanas. Trabajar con lípidos en forma de polvo es más preciso que utilizar lípidos ya solubilizados en CHCl₃. El CHCl₃ debe manipularse con pipetas de vidrio y/o jeringas y almacenarse en recipientes de vidrio, ya que el CHCl₃ disuelve los plásticos.
   2. Disuelva moléculas pequeñas (nucleótidos, aminoácidos, sondas ....

Discusión

Presentamos un protocolo para la síntesis de proteínas (de membrana) que contienen vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico (proteoLUVs), y la conversión de proteoLUVs en vesículas unilamelares gigantes (proteoGUVs). El protocolo debería ser aplicable para la reconstitución de otras proteínas de membrana 13,19,30,40 y la encapsulación de redes metabólicas distintas de la descomposición de L-arginina y las vías de síntesis de glicerol 3-fosfato presentadas aquí.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g