針の開口部のフィードバックのための一定の空気圧を利用したマイクロインジェクション針の湿式面取り

要約

このプロトコルは、針の面取りのプロセス中に加圧された空気を針に送達するための空気圧システムの組み立てを説明しています。このプロトコルでは、シャープなマイクロインジェクション針を作成するための面取りプロセスと、針の相対的な開口部のサイズを測定する方法についてさらに説明しています。

要約

マイクロインジェクション針は、ゲノム改変試薬、CRISPRコンポーネント(ガイドRNA、Cas9タンパク質、ドナーテンプレート)、トランスポゾンシステムコンポーネント(プラスミド、トランスポゼースmRNA)を発生中の昆虫胚に送達するための重要なツールです。鋭利なマイクロインジェクション針は、これらの修飾剤の送達中に特に重要です。なぜなら、それらは注入される胚への損傷を最小限に抑えるのに役立ち、それによって、斜めのない針による注射と比較してこれらの胚の生存率を高めるのに役立つからです。さらに、針の面取りは、物体(カバーガラスの側面、注入される胚の表面など)に対して針先をランダムに壊すことによって針先を壊すことによって開かれた針と比較して、針から針までより一貫した針を生成します。マイクロインジェクション針を一定の圧力で針に送り込む湿式面取りのプロセスにより、針を面取りする人は、針が開いているとき(気泡の存在)を知ることができ、針の開口部がどれだけ大きく作られたかを相対的に示すことができます。針の相対的な開口部のサイズは、平衡に達して針の先端から気泡が流れなくなるまで、針に供給される空気圧を調整することによって決定できます。平衡に達する圧力が低いほど、針のサイズは大きくなります。逆に、圧力が高いほど、針のサイズは小さくなります。

概要

昆虫の遺伝子組み換えは、もともとルービンとスプラドリングによってショウジョウバエで開発されたプロセスであり、長年にわたり、このプロセスは他の種で遺伝子組み換えを作成するために変更されてきました¹。このプロセスは、発生中の胚^2,3,4内の特定の時間と場所で胚にマイクロインジェクションされた修飾成分の正確な送達に依存しています。鋭利なマイクロインジェクション針は、蚊4,5,6,7,8,9やシロバエ¹⁰などの一部の昆虫の遺伝子改変の過程における重要なツールであるが、カイコ¹¹などの他の昆虫にとってはそれほど重要ではない。鋭い針は、遺伝子組み換え昆虫を作ろうとするとき、成功と失敗の間の重要な要素であることがよくあります^2,4。通常、マイクロキャピラリーガラス針は、ガラスが弾力性を持つポイントまでガラスを加熱することによって引っ張られ、キャピラリーを先細りの閉じた先端針に引き込むことができます。針を使用する前に、注射用の鋭い先端を作成するように針を開く必要があります。従来、針は、針の先端を何か(スライド/カバースリップの端、または胚など)に優しくブラッシングすることで開き、先端から少量のガラスが割れ、ランダムに鋭い先端が作られます^2,3。ややランダム性の低いプロセスは、針を光学的に平らで回転する研磨プレートに短時間すばやく下げるドライベベルで、針の先端から少量のガラスが摩耗し、先端が鋭くなります。ドライベベルは、針先を何かにブラッシングするよりも少しランダムではありません。以下に説明するプロトコルは、面取りされる針に圧縮空気を供給し、液体層の下で面取りすることにより、面取りプロセスをさらに一歩進めて、針が開かれるとすぐに気泡が見えるようにします。このプロトコルは、信頼性の高いシャープなマイクロインジェクション針を製造する方法を詳述しています。液体層の下で面取りすることは、上記のようにランダムに針を折るよりも改善されており、ユーザーが面取りプロセスに関するフィードバックを受け取るため、面取りする人は針が開いているときと針の開口部が比較的大きいかを知ることができます。針先の相対的な開口部のサイズを知ることで、面取りする人はさまざまな開口部サイズの針を作成できます。針の開口部のサイズが異なれば、利点も異なります。例えば、針の開口部のサイズが大きいほど、高粘度の注射剤の混合物に対応できますが、開口部の針が小さいほど、注入される胚へのダメージが少なくなります。

空気は、レギュレーターと、改良型空気圧調整注入システム²に基づくウレタンチューブのシステムを使用してニードルに供給されます。空気が一定の圧力で針に供給されている間、針は液体の層の下で面取りされます。面取り加工は、1)針を研磨面まで下げる、2)針を短時間面取りする、3)針を液層の表面下に保持しながら研磨板から離して持ち上げる、4)研磨板の回転を止めて気泡が出ないか確認する、の5段階の工程を繰り返しています。気泡が存在しない場合は、気泡が表示されるまでステップ 1 から 4 が繰り返されます。5)気泡が存在すると、空気圧を調整して、針の相対的な開口部のサイズを決定できます。気泡の形成を止めるために必要な圧力が低ければ低いほど、針先の開口部は大きくなります。

プロトコル

注:以下に説明するプロトコルでは、Sutter BV-10マイクロキャピラリーベベルを使用します。ただし、このプロトコルは、面取りされた任意のモデルマイクロキャピラリーで使用するために変更できます。

1. レギュレーター、圧力計、エア供給チューブの組立

1. 給気からレギュレーターのベースに接続するためのウレタンチューブの一部を切り取ります(R;セクション 1、 図 1)。このセクションの長さは、給気からベベラーの隣に配置されるレギュレーターまでの距離によって異なります。
2. ホースclをスライドさせますamp ウレタンチューブに、次にホースコネクタをチューブの端に押し込みます。ホースコネクタを硬い面に当てて、ホースコネクタが完全に挿入されていることを確認してください。チューブをホースコネクタに近づけたまま、ホースコネクタが完全に挿入されるまでチューブをホースにしっかりと押し込みます。ホースclamp とホースコネクタは一緒に接続HCを形成します(図1)。
3. ホースクランプを、ホースコネクタが挿入されているチューブの端までスライドさせます。ホースclを回転させますamp 挿入されたバーブの端の上で、気密接続を形成します。
4. ホースコネクタをレギュレーター(R)のベースに手でねじ込み、小さなレンチで接続を締め終えます。接続が気密性があり、きつすぎないことを確認してください。
5. レギュレーターのサイドポートで、Tコネクタ(T)を手でねじ込み、小さなレンチを使用して締め付けを終了します。
6. 長さ約3〜5cmのウレタンチューブ(図1、セクション2)の小片をカットします。2つのホースclを配置しますamp チューブの一部に、次にホースコネクタをチューブの両端に挿入し、チューブの両端の手順1.2〜1.4で説明されているように接続(HC)を終了します。
7. 短いチューブの一方の端を圧力計のベースにねじ込み、手順1.5のようにレンチで締め付けます。
8. 短いチューブのもう一方の端を、手順1.5でレギュレーターに接続されたTコネクタ(T)のポートの1つにねじ込みます。
9. レギュレーターとニードルホルダー(NH)を接続するために、ウレタンチューブの一部(図1、セクション3)を切断します。このセクションのサイズは、ベベラーからレギュレーターの位置までの距離によって異なります。
10. ホースclを置きますamp チューブセクションに、手順1.2〜1.4の説明に従ってホースコネクタを挿入します。
11. チューブのこのセクションの反対側に、ニードルホルダー(NH)に付属のメスルアーコネクタ(LC)を配置します。
12. 保持clを取り外しますamp マニピュレーターから保持とナイロンワッシャー(図2、f)。保持クランプとワッシャーは、ガラスマイクロキャピラリーのみを保持するように設計されており、マイクロキャピラリーホルダー、ネジ付きロッド、および空気供給チューブの追加重量を保持するようには設計されていません。
13. 長方形のゴムパッキンシート1.5 cm x 2 cmをカットして、ネジ付きロッドを自転車のフェンダークランプに巻き付けます。これにより、ネジ付きロッドとニードルホルダーを自転車のフェンダークランプによりしっかりと保持できます。2本のラジオペンチを使用して、自転車のフェンダークリップを開き、長方形のゴムパッキンシートをロッドの一方の端から3.5cmのネジ付きロッドに折り込み、ロッドの上にU字型を形成します。ゴムシートで覆われたネジ付きロッドを開いた自転車のフェンダークランプに挿入し、ペンチを使用してクランプを閉じますampロッドとゴムシートの周り。自転車clを取り付けますamp とネジ付きロッドアセンブリをマニピュレーターボルトに取り付け、保持clamp ナイロンワッシャーなしで、保持clamp ネジ付きロッドアセンブリをしっかりと保持するまで締めます。
14. ニードルホルダーをネジ付きロッドに通します。ルアーコネクタが、接続時にウレタンチューブを結合しない位置で終了していることを確認します(図2、g)。
15. メス型ルアーコネクタをニードルホルダー(図2、d)のオス型ルアーコネクタ(図2、g)に接続します。
16. 図1、セクション1チューブの自由端を空気供給に接続します(この接続は、使用する空気供給によって異なります)。空気供給は清潔で乾燥した空気で、油の残留物がないようにする必要があります。空気供給は、住宅の空気源またはガスボンベ、圧縮空気または窒素のいずれかから行うことができます。

2.ホウケイ酸針の面取り

1. ホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリーを使用して、装置上で次の設定でマイクロインジェクション針を引きます:熱:305、フィル:4、ベル:70、デル:235、プル:160、ループ時間12.24。
2. メーカーの指示に従って、研磨板と磁石¹²付きの保持リングからなる研削アセンブリを組み立てます。
   注意: 研磨プレートからPhoto-Flo(湿潤剤)が早期に漏れるのを防ぐために、研磨プレートは透明なフィルムの薄いストリップで包む必要がある場合があります。これは、湿潤剤溶液が台座油に早期に漏れ出し、粉砕プレートの回転が停止する場合にのみ必要です。湿潤剤は、面取り後にガラス針の跡が乾燥するリスクを軽減します。湿潤剤の使用は面取りプロセスにとって重要ではなく、水で代用できます。
3. 台座の光学的に平らな面に10滴の台座オイルを置き、研削アセンブリを上に置きます。研削アセンブリを開始します。
4. 光源をオンにして表面を照らします。光源が面取りされたものの後ろに配置され、研磨プレートと針に対して45°の角度で照らしていることを確認します。針の影が見えやすいように、照明角度が必要です。90倍の倍率で、顕微鏡ヘッドを所定の位置に回転させます。研磨板の回転を一時停止し、顕微鏡を研磨板の表面に焦点を合わせます。
5. 芯が完全に濡れるまで、芯に1%の湿潤剤を加えます。研磨板の表面に1%の湿潤剤を添加します。湿潤剤が研磨面を覆っているが、黒い保持リングに漏れていないことを確認してください。
6. プレウェットウィックを砥粒プレートが回転しているときに、研磨プレートの表面に置きます。芯が研磨プレートの左側にあり(上から見下ろすとき)、11時から6時まで伸びていることを確認します(プレートを時計の文字盤として)。芯がリテーニングリングの黒い部分に乗らないようにしてください。
7. 針を針ホルダー(図2、d)に挿入し、保持リングを締めて針を所定の位置に保持します。レギュレーターを開き(図1、R)、圧力を24psiに上げます。
8. コース調整ノブを回して針ホルダーを持ち上げます(図2、a)針が回転する研磨板の表面よりも高くなるほど高く持ち上げられていることを確認してから、マニピュレーター全体を回転させて、針が回転する研磨板の上の所定の位置にスイングするようにします。面取りする針は、プレートの回転が針の先端から離れるように向きを変えて、回転する研磨プレートに配置する必要があります(図3A)
9. 横から見ながら、粗調整ノブ(図2、a)を使用して、針を研磨板の表面に向かって下げます。針が液体の表面にほぼ触れたら停止します。
10. ズームを使用して顕微鏡の倍率を下げてから、針が視野の中心にくるように顕微鏡を動かします。視界の中心に来たら、倍率を上げ、針先が視界の中心に留まるようにマニピュレーターの位置を調整します。最大倍率にしたら、研削プレートを停止して顕微鏡を研磨プレートの表面に焦点を合わせ、表面に焦点が合ったらすぐにプレートの回転を再開します。この時点では、針が見えていない可能性があります。
11. マニピュレーターの粗調整ノブを使用して、針を研磨板に向かって下げます。視野内には、針の画像と針の影が表示されます。針と針の影が接触しそうになったら、マニピュレーター微調整ノブに切り替えて、針とその影が接触して見えるまで針を下げ続けます。この時点で、キャリパー(図2、c)を読み取り、読み取りをメモします。研磨板の表面は、このキャリパーの読み取り値以下にあります。
    注意: 針が回転する研磨板の表面に触れると見づらいため、この時点では針が実際には研磨板に触れていない可能性があります。
12. 針がこのレベルのキャリパー読み取りに5〜10秒間留まるようにします。
13. マニピュレーター微調整ノブを使用して、針を持ち上げ、濡れ剤の表面の下に留まることを確認します。研磨板の回転を数秒間停止し、針先から気泡が逃げるかどうかを確認します。気泡が存在する場合は、手順2.15に進みます。気泡が存在しない場合は、手順 2.14 に進みます。
14. マニピュレーターの微調整ノブを使用して針をキャリパーの読み取り値に戻し、少し下に動かして新しいキャリパーの読み取りを行い、手順2.12〜2.13を繰り返します。
15. 研磨板を再度開始して、プレートが回転している間に気泡の形成が観察できるかどうかを確認します。プレートの回転中に気泡形成の証拠が見られる場合、針先の開口部は、蚊の胚注射などの敏感な胚マイクロインジェクションには大きすぎる可能性があります。研磨プレートの回転中に気泡の形成が見えない場合、針の開口部は、鋭くて小さな開口部の針を必要とする手順での使用に最適です。
16. マニピュレーターのコース調整ノブを使用して、マニピュレーター全体を回転させて針を研磨板と顕微鏡から遠ざけるときに針が何も当たらないように、針を研磨板の上の十分に高い位置まで研磨板の上に上げます。
17. 針が何も当たらずに取り外せる位置になったら、空気圧をゼロに下げて針を取り外し、針収納ボックス(両面テープまたは斜めの針を保持するためのモデリングクレイのいずれかを備えたペトリ皿)に使用まで置きます。

3.斜めの針の相対的な開口部のサイズを決定する

注意: 面取りされた針の相対的な開口部のサイズを決定するには、手順2.13で行います。以下の手順では、このプロセスについて詳しく説明します。

1. ステップ2.13で気泡が観察されたら、研磨板が回転していない状態で、レギュレーター調整ノブ(図1、R)を回して、針の先端から気泡が流れなくなるまで空気圧をゆっくりと下げます。先端から気泡が流れなくなる圧力に注意してください。
2. 針先から再び気泡が流れるまで空気圧を上げます。圧力が高いほど、針の開口部は小さくなります。
3. 針を安全に取り外すことができる位置まで針を動かします ステップ2.16-2.17。

結果

上記の手順により、一貫して鋭いマイクロインジェクション針が得られます。鋭利な針は、蚊の胚などの柔らかい絨毛膜昆虫の胚に、胚膜からの抵抗がほとんどまたはまったくないのが特徴です。蚊の胚を遺伝子組み換えのためにマイクロインジェクションすると、胚の膜は比較的弾力性があります。鈍い針を胚の膜に押し付けると、胚の膜がへこみます(

ディスカッション

蚊の遺伝子組み換えは、胚盤葉前胚3,4,5,6,7,8への改変材料(プラスミド、ガイドRNA、またはタンパク質)の精密なマイクロインジェクションに依存している。このプロセスに重要なのは、注入中に胚を容易に突き刺す鋭い?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050