針の開口部のフィードバックのための一定の空気圧を利用したマイクロインジェクション針の湿式面取り

要約

このプロトコルは、針の面取りのプロセス中に加圧された空気を針に送達するための空気圧システムの組み立てを説明しています。このプロトコルでは、シャープなマイクロインジェクション針を作成するための面取りプロセスと、針の相対的な開口部のサイズを測定する方法についてさらに説明しています。

要約

マイクロインジェクション針は、ゲノム改変試薬、CRISPRコンポーネント(ガイドRNA、Cas9タンパク質、ドナーテンプレート)、トランスポゾンシステムコンポーネント(プラスミド、トランスポゼースmRNA)を発生中の昆虫胚に送達するための重要なツールです。鋭利なマイクロインジェクション針は、これらの修飾剤の送達中に特に重要です。なぜなら、それらは注入される胚への損傷を最小限に抑えるのに役立ち、それによって、斜めのない針による注射と比較してこれらの胚の生存率を高めるのに役立つからです。さらに、針の面取りは、物体(カバーガラスの側面、注入される胚の表面など)に対して針先をランダムに壊すことによって針先を壊すことによって開かれた針と比較して、針から針までより一貫した針を生成します。マイクロインジェクション針を一定の圧力で針に送り込む湿式面取りのプロセスにより、針を面取りする人は、針が開いているとき(気泡の存在)を知ることができ、針の開口部がどれだけ大きく作られたかを相対的に示すことができます。針の相対的な開口部のサイズは、平衡に達して針の先端から気泡が流れなくなるまで、針に供給される空気圧を調整することによって決定できます。平衡に達する圧力が低いほど、針のサイズは大きくなります。逆に、圧力が高いほど、針のサイズは小さくなります。

概要

昆虫の遺伝子組み換えは、もともとルービンとスプラドリングによってショウジョウバエで開発されたプロセスであり、長年にわたり、このプロセスは他の種で遺伝子組み換えを作成するために変更されてきました¹。このプロセスは、発生中の胚^2,3,4内の特定の時間と場所で胚にマイクロインジェクションされた修飾成分の正確な送達に依存しています。鋭利なマイクロインジェクション針は、蚊4,5,6,7,8,9やシロバエ¹⁰などの一部の昆虫の遺伝子改変の過程における重要なツールであるが、カイコ¹¹などの他の昆虫にとってはそれほど重要ではない。鋭い針は、遺伝子組み換え昆虫を作ろ....

プロトコル

注:以下に説明するプロトコルでは、Sutter BV-10マイクロキャピラリーベベルを使用します。ただし、このプロトコルは、面取りされた任意のモデルマイクロキャピラリーで使用するために変更できます。

1. レギュレーター、圧力計、エア供給チューブの組立

1. 給気からレギュレーターのベースに接続するためのウレタンチューブの一部を切り取ります(R;セクション 1、 図 1)。このセクションの長さは、給気からベベラーの隣に配置されるレギュレーターまでの距離によって異なります。
2. ホースclをスライドさせますamp ウレタンチューブに、次にホースコネクタをチューブの端に押し込みます。ホースコネクタを硬い面に当てて、ホースコネクタが完全に挿入されていることを確認してください。チューブをホースコネクタに近づけたまま、ホースコネクタが完全に挿入されるまでチューブをホースにしっかりと押し込みます。ホースclamp とホースコネクタは一緒に接続HCを形成します(図1)。
3. ホースクランプを、ホースコネクタが挿入されているチューブの端までスライドさせます。ホースclを回転させますamp 挿入されたバーブの端の上で、気密接続を形....

ディスカッション

蚊の遺伝子組み換えは、胚盤葉前胚3,4,5,6,7,8への改変材料(プラスミド、ガイドRNA、またはタンパク質)の精密なマイクロインジェクションに依存している。このプロセスに重要なのは、注入中に胚を容易に突き刺す鋭い?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050