Chanfro úmido de agulhas de microinjeção utilizando pressão de ar constante para feedback sobre a abertura da agulha

Resumo

Este protocolo descreve a montagem de um sistema pneumático para o fornecimento de ar pressurizado a uma agulha durante o processo de biselamento da agulha. O protocolo descreve ainda o processo de chanfro para criar agulhas de microinjeção afiadas e como medir o tamanho relativo da abertura da agulha.

Resumo

As agulhas de microinjeção são uma ferramenta crítica na entrega de reagentes de modificação do genoma, componentes CRISPR (RNAs guia, proteína Cas9 e modelo de doador) e componentes do sistema de transposons (plasmídeos e mRNA de transposase) em embriões de insetos em desenvolvimento. Agulhas afiadas de microinjeção são particularmente importantes durante a administração desses agentes modificadores, pois ajudam a minimizar os danos ao embrião que está sendo injetado, aumentando assim a sobrevivência desses embriões em comparação com a injeção com agulhas não chanfradas. Além disso, o chanfro de agulhas produz agulhas que são mais consistentes de agulha para agulha em comparação com agulhas abertas quebrando aleatoriamente a ponta da agulha escovando a ponta contra um objeto (lado de uma lamínula, a superfície do embrião a ser injetado, etc.). O processo de chanfro úmido de agulhas de microinjeção com ar de pressão constante entregue à agulha permite que a pessoa que chanfra a agulha saiba quando a agulha está aberta (presença de bolhas) e também dá uma indicação relativa de quão grande foi a abertura da agulha. O tamanho relativo da abertura na agulha pode ser determinado ajustando a pressão do ar fornecida à agulha até que um equilíbrio seja alcançado e as bolhas parem de fluir da ponta da agulha. Quanto menor a pressão na qual o equilíbrio é alcançado, maior o tamanho da agulha; e, inversamente, quanto maior a pressão, menor o tamanho da agulha.

Introdução

A modificação genética de insetos é um processo originalmente desenvolvido em Drosophila por Rubin e Spradling e, ao longo dos anos, esse processo foi modificado para criar modificações genéticas em outras espécies¹. O processo depende da entrega precisa de componentes de modificação microinjetados em embriões em uma janela específica de tempo e local dentro do embrião em desenvolvimento ^2,3,4. Agulhas afiadas de microinjeção são uma ferramenta crítica no processo de modificação genética de alguns insetos, como mosquitos 4,5,6,7,8,9 e flebotomíneos ¹⁰, embora não sejam tão críticas para outros insetos, como bichos-da-seda¹¹. Agulhas afiadas costumam ser um fator chave entre o sucesso e o fracasso ao tentar criar um inseto geneticamente modificado ^2,4. Normalmente, as agulhas de vidro microcapilar são puxadas aquecendo o vidro até o ponto em que o vidro se torna elástico, permitindo que o capilar seja puxado para dentro de uma agulha de ponta fechada afilada. Antes que a agulha possa ser usada, ela precisa ser aberta de uma maneira que crie uma ponta afiada para injeção. Tradicionalmente, as agulhas são abertas escovando a ponta da agulha suavemente contra algo (a borda de uma lâmina / lamínula, ou o embrião, etc.) que faz com que uma pequena quantidade de vidro se solte da ponta, criando aleatoriamente uma ponta afiada ^2,3. Um processo um pouco menos aleatório é o chanfro a seco, onde a agulha é rapidamente abaixada em uma placa abrasiva giratória opticamente plana por um curto período de tempo, fazendo com que uma pequena quantidade de vidro seja desgastada da ponta da agulha, criando uma ponta afiada. O chanfro seco é um pouco menos aleatório do que roçar a ponta da agulha contra algo. O protocolo descrito abaixo leva o processo de chanfro um passo adiante, fornecendo ar comprimido para a agulha que está sendo chanfrada e chanfrando-a sob uma camada líquida para que as bolhas sejam visíveis assim que a agulha for aberta. Este protocolo detalha um método para produzir agulhas de microinjeção afiadas de forma confiável. O chanfro sob uma camada líquida é uma melhoria em relação à quebra aleatória da agulha, conforme descrito acima, e o chanfro a seco porque o usuário recebe feedback sobre o processo de chanfro, permitindo que a pessoa que chanfra saiba quando a agulha está aberta e relativamente quão grande é a abertura da agulha. Saber o tamanho relativo da abertura da ponta da agulha pode permitir que a pessoa que está chanfrando crie agulhas com diferentes tamanhos de abertura. Vários tamanhos de abertura da agulha têm vantagens diferentes; Por exemplo, tamanhos maiores de abertura da agulha podem acomodar misturas de injeção de alta viscosidade, enquanto agulhas de abertura menores causam menos danos ao embrião que está sendo injetado.

O ar é fornecido à agulha usando um regulador e um sistema de tubulação de uretano baseado em um sistema de injeção regulado por pressão de ar modificado². Enquanto o ar é fornecido à agulha a uma pressão constante, a agulha é chanfrada sob uma camada de líquido. O processo de chanfro é composto por um processo repetido de cinco etapas: 1) abaixar a agulha até a superfície abrasiva, 2) permitir que a agulha chanfre por um curto período de tempo, 3) levantar a agulha para longe da placa abrasiva, mantendo-a abaixo da superfície da camada líquida, 4) parar a rotação da placa abrasiva para verificar o aparecimento de bolhas. Se nenhuma bolha estiver presente, as etapas 1 a 4 serão repetidas até que as bolhas apareçam; 5) Uma vez que as bolhas estejam presentes, a pressão do ar pode ser ajustada para determinar o tamanho relativo da abertura da agulha. Quanto menor a pressão necessária para impedir a formação de bolhas, maior a abertura na ponta da agulha.

Protocolo

NOTA: O protocolo descrito abaixo usa o microcapilar chanfrado Sutter BV-10. No entanto, este protocolo pode ser modificado para uso com qualquer modelo de chanfro microcapilar.

1. Montagem do regulador, manômetro e tubulação de suprimento de ar

1. Corte uma seção da tubulação de uretano para a conexão do suprimento de ar à base do regulador (R; Seção 1, Figura 1). O comprimento desta seção dependerá da distância do suprimento de ar ao regulador, que estará localizado próximo ao chanfro.
2. Deslize uma mangueira clamp na tubulação de uretano e, em seguida, empurre um conector de mangueira na extremidade da tubulação. Certifique-se de que o conector da mangueira esteja totalmente inserido, colocando-o contra uma superfície dura. Enquanto segura a tubulação perto do conector da mangueira, pressione a tubulação firmemente na mangueira até que o conector da mangueira esteja totalmente inserido. Juntos, a braçadeira da mangueira e o conector da mangueira formam a conexão HC (Figura 1).
3. Deslize a mangueira clamp até a extremidade da tubulação onde o conector da mangueira está inserido. Gire a mangueira clamp sobre a extremidade da farpa inserida para que ela forme uma conexão hermética.
4. Aparafuse o conector da mangueira na base do regulador (R) manualmente e, em seguida, termine de apertar a conexão com uma pequena chave. Certifique-se de que a conexão seja hermética, mas não muito apertada.
5. Na porta lateral do regulador, aparafuse um conector T (T) manualmente e, em seguida, use uma pequena chave inglesa para terminar de apertar.
6. Corte um pequeno pedaço de tubo de uretano (Figura 1, Seção 2), com aproximadamente 3-5 cm de comprimento. Coloque duas mangueiras clamps no pedaço de tubo, em seguida, insira um conector de mangueira em cada extremidade da tubulação e termine as conexões (HC) conforme descrito nas etapas 1.2-1.4 para cada extremidade do tubo.
7. Aparafuse uma extremidade do tubo curto na base do manômetro e, em seguida, termine de apertar com uma chave inglesa como na etapa 1.5.
8. Aparafuse a outra extremidade do tubo curto em uma das portas do conector T (T) conectado ao regulador na etapa 1.5.
9. Corte uma seção do tubo de uretano (Figura 1, Seção 3) para a conexão entre o regulador e o porta-agulha (NH). O tamanho desta seção dependerá da distância do chanfrador até a localização do regulador.
10. Coloque uma mangueira clamp na seção da tubulação e, em seguida, insira um conector de mangueira conforme descrito nas etapas 1.2-1.4.
11. Do outro lado desta seção da tubulação, coloque o conector luer fêmea (LC) que é fornecido com o porta-agulha (NH).
12. Remova o grampo de retenção e a arruela de náilon (Figura 2, f) do manipulador. A braçadeira de retenção e a arruela são projetadas para segurar apenas um microcapilar de vidro, elas não são projetadas para suportar o peso adicional de um suporte microcapilar, haste roscada e tubulação de suprimento de ar.
13. Corte um pedaço retangular de folha de borracha de 1,5 cm x 2 cm para enrolar a haste roscada na braçadeira do para-lama da bicicleta. Isso ajudará a segurar a haste rosqueada e o porta-agulha com mais segurança no grampo do para-lama da bicicleta. Usando um alicate de bico fino, abra o clipe do para-lama da bicicleta, dobre o pedaço retangular da folha de borracha sobre a haste roscada a 3,5 cm de uma extremidade da haste para formar um U sobre a haste. Insira a haste rosqueada coberta de folha de borracha no para-lama aberto da bicicleta clamp e use o alicate para fechar o clamp ao redor da haste e da folha de borracha. Instale a bicicleta clamp e o conjunto da haste rosqueada no parafuso do manipulador, substitua o clamp de retenção sem a arruela de náilon e aperte o clamp de retenção até que ele segure firmemente o conjunto da haste rosqueada.
14. Passe o porta-agulha na haste roscada. Certifique-se de que o conector luer termine em uma posição que não prenda a tubulação de uretano quando estiver conectada (Figura 2, g).
15. Conecte o conector luer fêmea ao conector luer macho (Figura 2, g) do porta-agulha (Figura 2, d).
16. Conecte a extremidade livre do tubo da Figura 1, Seção 1 ao suprimento de ar (essa conexão varia de acordo com o suprimento de ar usado). O suprimento de ar deve ser limpo, seco e livre de resíduos de óleo. O suprimento de ar pode ser de uma fonte de ar doméstica ou cilindro de gás, seja ar comprimido ou nitrogênio.

2. Agulhas de borossilicato de chanfro

1. Puxe as agulhas de microinjeção usando microcapilares de vidro borossilicato com as seguintes configurações no instrumento: Calor: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, com tempo de loop de 12.24.
2. Monte o conjunto de retificação de acordo com as instruções do fabricante, consistindo na placa abrasiva e no anel de retenção com ímãs¹².
   NOTA: A placa abrasiva pode precisar ser envolvida com uma tira fina de filme transparente para evitar vazamento prematuro de Photo-Flo (agente umectante) da placa abrasiva. Isso só é necessário se a solução do agente umectante vazar prematuramente para o óleo do pedestal, fazendo com que a placa de moagem pare de girar. O agente umectante reduz o risco de marcas de secagem nas agulhas de vidro após o chanfro. O uso de um agente umectante não é crítico para o processo de chanfro, e a água pode ser substituída.
3. Coloque 10 gotas de óleo de pedestal na superfície opticamente plana do pedestal e coloque o conjunto de moagem por cima. Inicie o conjunto de moagem.
4. Ligue a fonte de luz para iluminar a superfície. Certifique-se de que a fonte de luz esteja posicionada atrás do chanfro e brilhe em um ângulo de 45° em relação à placa abrasiva e à agulha. O ângulo de iluminação é necessário para que uma sombra da agulha seja facilmente vista. Com ampliação de 90x, gire a cabeça do microscópio no lugar. Pare brevemente a rotação da placa abrasiva e concentre o microscópio na superfície da placa abrasiva.
5. Adicione 1% de agente umectante ao pavio até que o pavio esteja completamente molhado. Adicione 1% de agente umectante à superfície da placa abrasiva. Certifique-se de que o agente umectante cubra a superfície abrasiva, mas não vaze para o anel de retenção preto.
6. Coloque o pavio pré-molhado na superfície da placa abrasiva enquanto ela está girando. Certifique-se de que o pavio esteja no lado esquerdo da placa abrasiva (ao olhar de cima para baixo) e se estenda das 11 horas às 6 horas (com a placa como um relógio). Certifique-se de que o pavio não ande na parte preta do anel de retenção.
7. Insira uma agulha no porta-agulha (Figura 2, d) e aperte o anel de retenção para manter a agulha no lugar. Abra o regulador (Figura 1, R) e aumente a pressão para 24 psi.
8. Levante o porta-agulha girando o botão de ajuste de curso (Figura 2, a) Certifique-se de que a agulha esteja levantada o suficiente para ficar mais alta do que a superfície da placa abrasiva rotativa e, em seguida, gire todo o manipulador para que a agulha se encaixe acima da placa abrasiva rotativa. A agulha a ser chanfrada deve ser colocada na placa abrasiva rotativa orientada de forma que a rotação da placa se afaste da ponta da agulha (Figura 3A)
9. Observando de lado, use o botão de ajuste grosso (Figura 2, a) para abaixar a agulha em direção à superfície da placa abrasiva. Pare quando a agulha estiver quase tocando a superfície do líquido.
10. Use o zoom para diminuir a ampliação do microscópio e, em seguida, mova o microscópio para que a agulha fique no centro do campo de visão. Uma vez no centro da visão, aumente a ampliação, ajustando a posição do manipulador para que a ponta da agulha permaneça no centro da visão. Uma vez na ampliação máxima, pare a placa de moagem e concentre o microscópio na superfície da placa abrasiva e, em seguida, reinicie imediatamente a rotação da placa assim que a superfície estiver em foco. A agulha pode não estar à vista neste momento.
11. Usando o botão de ajuste grosso do manipulador, abaixe a agulha em direção à placa abrasiva. No campo de view, uma imagem da agulha e uma(s) sombra(s) da agulha serão visíveis. Quando a agulha e a(s) sombra(s) da agulha estiverem perto de se tocar, mude para o botão de ajuste fino do manipulador e continue a abaixar a agulha até que a agulha e sua(s) sombra(s) pareçam se tocar. Neste ponto, leia o paquímetro (Figura 2, c) e anote a leitura. A superfície da placa abrasiva está igual ou abaixo dessa leitura do paquímetro.
    NOTA: É difícil ver quando a agulha toca a superfície da placa abrasiva rotativa, portanto, a agulha pode não estar realmente tocando a placa abrasiva neste momento.
12. Deixe a agulha permanecer neste nível de leitura do paquímetro por 5 a 10 s.
13. Usando o botão de ajuste fino do manipulador, levante a agulha, certificando-se de que ela fique embaixo da superfície do agente umectante. Pare a rotação da placa abrasiva por alguns segundos e observe se as bolhas escapam da ponta da agulha. Se houver bolhas, vá para a etapa 2.15. Se não houver bolhas, vá para a etapa 2.14.
14. Mova a agulha de volta para a leitura do paquímetro usando o botão de ajuste fino do manipulador, depois mova-a um pouco para baixo e faça uma nova leitura do paquímetro e repita as etapas 2.12-2.13.
15. Inicie a placa abrasiva novamente para ver se a formação de bolhas é observável enquanto a placa está girando. Se a evidência de formação de bolhas for visível durante a rotação da placa, a abertura da ponta da agulha provavelmente é muito grande para microinjeções de embriões sensíveis, como injeções de embriões de mosquito. Se a formação de bolhas não for visível durante a rotação da placa abrasiva, a abertura da agulha é ideal para uso em procedimentos que exigem uma agulha de abertura pequena e afiada.
16. Use o botão de ajuste do curso do manipulador para elevar a agulha acima da placa abrasiva para uma posição alta o suficiente acima da placa para que a agulha não atinja nada, pois todo o manipulador é girado para afastar a agulha da placa abrasiva e do microscópio.
17. Quando a agulha estiver em uma posição em que possa ser removida sem bater em nada, abaixe a pressão do ar para zero, remova a agulha e coloque-a em uma caixa de armazenamento de agulhas (uma placa de Petri com fita adesiva dupla ou massa de modelar para segurar as agulhas chanfradas) até o uso.

3. Determinando o tamanho relativo da abertura da agulha chanfrada

NOTA: A determinação dos tamanhos relativos de abertura da agulha chanfrada é feita na etapa 2.13. As etapas abaixo descrevem melhor esse processo.

1. Uma vez observadas bolhas na etapa 2.13, com a placa abrasiva sem girar, diminua lentamente a pressão do ar girando o botão de ajuste do regulador (Figura 1, R) até que as bolhas parem de fluir da ponta da agulha. Observe a pressão na qual as bolhas param de fluir da ponta.
2. Aumente a pressão do ar até que as bolhas fluam novamente da ponta da agulha. Quanto maior a pressão, menor a abertura da agulha.
3. Prossiga movendo a agulha para uma posição onde possa ser removida com segurança as etapas 2.16-2.17.

Resultados

O procedimento descrito acima produz agulhas de microinjeção consistentemente afiadas. Agulhas afiadas são caracterizadas por serem capazes de se inserir em embriões de insetos coriões moles, como embriões de mosquitos, com pouca ou nenhuma resistência da membrana embrionária. Quando os embriões de mosquito são microinjetados para modificação genética, a membrana do embrião é relativamente elástica. Empurrar uma agulha cega contra a membrana do embrião fará com que ela ...

Discussão

A modificação genética de mosquitos depende da microinjeção precisa dos materiais de modificação (plasmídeos, RNAs guia ou proteínas) em embriões pré-blastoderma 3,4,5,6,7,8. Cruciais para esse processo são agulhas afiadas que perfuram facilmente o embrião durante a injeção

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050