Biselado húmedo de agujas de microinyección que utiliza presión de aire constante para obtener información sobre la apertura de la aguja

Resumen

Este protocolo describe el montaje de un sistema neumático para el suministro de aire presurizado a una aguja durante el proceso de biselado de la aguja. El protocolo describe con más detalle el proceso de biselado para crear agujas de microinyección afiladas y cómo medir el tamaño relativo de la abertura de la aguja.

Resumen

Las agujas de microinyección son una herramienta fundamental en la entrega de reactivos de modificación del genoma, componentes CRISPR (ARN guía, proteína Cas9 y plantilla de donante) y componentes del sistema de transposones (plásmidos y ARNm de transposasa) en embriones de insectos en desarrollo. Las agujas de microinyección afiladas son particularmente importantes durante la administración de estos agentes modificadores, ya que ayudan a minimizar el daño al embrión que se inyecta, aumentando así la supervivencia de estos embriones en comparación con la inyección con agujas no biseladas. Además, el biselado de las agujas produce agujas que son más consistentes de una aguja a otra en comparación con las agujas abiertas rompiendo aleatoriamente la punta de la aguja al rozar la punta contra un objeto (el costado de un cubreobjetos, la superficie del embrión que se va a inyectar, etc.). El proceso de biselado húmedo de agujas de microinyección con aire a presión constante suministrado a la aguja permite a la persona que bisela la aguja saber cuándo la aguja está abierta (presencia de burbujas) y también da una indicación relativa de qué tan grande se ha creado una abertura de la aguja. El tamaño relativo de la abertura en la aguja se puede determinar ajustando la presión de aire suministrada a la aguja hasta que se alcance un equilibrio y las burbujas dejen de fluir desde la punta de la aguja. Cuanto menor sea la presión a la que se alcance el equilibrio, mayor será el tamaño de la aguja; y a la inversa, cuanto mayor sea la presión, menor será el tamaño de la aguja.

Introducción

La modificación genética de insectos es un proceso desarrollado originalmente en Drosophila por Rubin y Spradling, y a lo largo de los años, este proceso se ha modificado para crear modificaciones genéticas en^{otras especies}. El proceso se basa en la entrega precisa de componentes de modificación microinyectados en embriones en una ventana de tiempo y lugar específicos dentro del embrión en desarrollo ^2,3,4. Las agujas afiladas de microinyección son una herramienta crítica en el proceso de modificación genética de algun....

Protocolo

NOTA: El protocolo que se describe a continuación utiliza el biselado microcapilar Sutter BV-10. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para su uso con cualquier modelo microcapilar biselado.

1. Montaje del regulador, manómetro y tubo de suministro de aire

1. Corte una sección de tubo de uretano para la conexión desde el suministro de aire hasta la base del regulador (R; Sección 1, Figura 1). La longitud de esta sección dependerá de la distancia desde el suministro de aire hasta el regulador, que se ubicará junto a la biseladora.
2. Desl....

Resultados

El procedimiento descrito anteriormente produce agujas de microinyección consistentemente afiladas. Las agujas afiladas se caracterizan por ser capaces de insertarse en embriones blandos de insectos corion, como los embriones de mosquitos, con poca o ninguna resistencia de la membrana embrionaria. Cuando los embriones de mosquito se microinyectan para la modificación genética, la membrana embrionaria es relativamente elástica. Empujar una aguja desafilada contra la membrana del embri.......

Discusión

La modificación genética de los mosquitos se basa en la microinyección precisa de los materiales de modificación (plásmidos, ARN guía o proteínas) en embriones pre-blastodermo 3,4,5,6,7,8. Cruciales para este proceso son las agujas afiladas que perforan fácilmente el embrión durante .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050