Мокрое снятие фаски с игл для микроинъекций с использованием постоянного давления воздуха для обратной связи при открытии иглы

Резюме

В этом протоколе описывается сборка пневматической системы для подачи сжатого воздуха к игле в процессе снятия фаски с иглы. В протоколе также описывается процесс снятия фаски для создания острых игл для микроинъекций и то, как измерить относительный размер отверстия иглы.

Аннотация

Иглы для микроинъекций являются важнейшим инструментом для доставки реагентов для модификации генома, компонентов CRISPR (направляющих РНК, белка Cas9 и донорской матрицы) и компонентов системы транспозонов (плазмид и мРНК транспозазы) в развивающиеся эмбрионы насекомых. Острые иглы для микроинъекций особенно важны во время доставки этих модифицирующих агентов, поскольку они помогают свести к минимуму повреждение инъецируемого эмбриона, тем самым увеличивая выживаемость этих эмбрионов по сравнению с инъекциями иглами без скоса. Кроме того, при снятии фаски иглы получаются иглы, которые более однородны от иглы к игле по сравнению с иглами, вскрытыми путем случайного ломания кончика иглы путем прикосновения кончика к объекту (стороне покровного стекла, поверхности эмбриона, который будет введен и т. д.). Процесс влажного снятия фаски с игл для микроинъекций с подачей воздуха к игле под постоянным давлением позволяет человеку, снимающему фаску с иглы, знать, когда игла открыта (наличие пузырьков), а также дает относительное представление о том, насколько большое отверстие иглы было создано. Относительный размер отверстия в игле можно определить, регулируя давление воздуха, подаваемого на иглу, до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие и пузырьки не перестанут вытекать из кончика иглы. Чем ниже давление, при котором достигается равновесие, тем больше размер иглы; И наоборот, чем выше давление, тем меньше размер иглы.

Введение

Генетическая модификация насекомых — это процесс, первоначально разработанный у дрозофил Рубином и Спрэдлингом, и с годами этот процесс был модифицирован для создания генетических модификаций у^{других видов.} Процесс основан на точной доставке компонентов модификации, микроинъецированных в эмбрионы в определенный промежуток времени и в определенном месте внутри развивающегося эмбриона ^2,3,4. Острые иглы для микроинъекций являются критически важным инструментом в процессе генетической модификации некоторых насекомых, таки....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном ниже, используется микрокапиллярный скошенный Sutter BV-10. Тем не менее, этот протокол может быть модифицирован для использования с любой моделью с микрокапиллярной скошенностью.

1. Сборка регулятора, манометра и трубки подачи воздуха

1. Отрезать участок уретановой трубки для подключения от подачи воздуха к основанию регулятора (R; Раздел 1, Рисунок 1). Длина этого участка будет зависеть от расстояния от подачи воздуха до регулятора, который будет расположен рядом со станком для снятия фаски.
2. Наденьте хомут д....

Результаты

Описанная выше процедура позволяет получать стабильно острые иглы для микроинъекций. Острые иглы характеризуются способностью вставлять в мягкие эмбрионы насекомых хориона, таких как эмбрионы комаров, практически без сопротивления со стороны оболочки эмбриона. Ко?.......

Обсуждение

Генетическая модификация комаров основана на точном микроинъекционном вводе модифицирующих материалов (плазмид, направляющих РНК или белков) в эмбрионы, предшествующие бластодерме 3,4,5,6,7,8.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050