Nassanfasen von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck zur Rückmeldung der Nadelöffnung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Montage eines pneumatischen Systems zur Abgabe von Druckluft an eine Nadel während des Prozesses des Anfasens der Nadel. Das Protokoll beschreibt ferner den Anfasprozess zur Herstellung scharfer Mikroinjektionsnadeln und wie die relative Öffnungsgröße der Nadel gemessen wird.

Zusammenfassung

Mikroinjektionsnadeln sind ein wichtiges Werkzeug bei der Verabreichung von Reagenzien zur Genommodifikation, CRISPR-Komponenten (Guide-RNAs, Cas9-Protein und Donor-Template) und Komponenten des Transposon-Systems (Plasmide und Transposase-mRNA) in sich entwickelnde Insektenembryonen. Scharfe Mikroinjektionsnadeln sind bei der Verabreichung dieser Modifikationsmittel besonders wichtig, da sie dazu beitragen, Schäden am zu injizierenden Embryo zu minimieren und dadurch das Überleben dieser Embryonen im Vergleich zur Injektion mit nicht abgeschrägten Nadeln zu erhöhen. Darüber hinaus erzeugt das Abschrägen von Nadeln Nadeln, die von Nadel zu Nadel konsistenter sind, verglichen mit Nadeln, die durch zufälliges Brechen der Nadelspitze geöffnet werden, indem die Spitze gegen ein Objekt gestreift wird (Seite eines Deckglases, die Oberfläche des zu injizierenden Embryos usw.). Das Verfahren des Nassanfasens von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck, die der Nadel zugeführt wird, ermöglicht es der Person, die die Nadel anfas, zu wissen, wann die Nadel offen ist (Vorhandensein von Blasen) und gibt auch einen relativen Hinweis darauf, wie groß eine Nadelöffnung entstanden ist. Die relative Öffnungsgröße in der Nadel kann bestimmt werden, indem der an die Nadel abgegebene Luftdruck angepasst wird, bis ein Gleichgewicht erreicht ist und keine Blasen mehr aus der Nadelspitze fließen. Je niedriger der Druck ist, bei dem das Gleichgewicht erreicht wird, desto größer ist die Nadelstärke; Und umgekehrt gilt: Je höher der Druck, desto kleiner die Nadelstärke.

Einleitung

Die genetische Modifikation von Insekten ist ein Verfahren, das ursprünglich von Rubin und Spradling in Drosophila entwickelt wurde und im Laufe der Jahre modifiziert wurde, um genetische Veränderungen bei anderen Arten^{zu erzeugen 1}. Der Prozess beruht auf der präzisen Abgabe von Modifikationskomponenten, die in einem bestimmten Zeit- und Ortsfenster innerhalb des sich entwickelnden Embryos mikroinjiziert werden ^2,3,4. Scharfe Mikroinjektionsnadeln sind ein wichtiges Werkzeug im Prozess der genetischen Veränderung einiger Insekten, wie z. B. Mücken 4,5,6,7,8,9 und Sandmücken 10, während sie für andere Insekten wie Seidenraupen ¹¹ nicht so kritisch sind. Scharfe Nadeln sind oft ein Schlüsselfaktor für Erfolg und Misserfolg bei dem Versuch, ein gentechnisch verändertes Insekt zu erzeugen ^2,4. Typischerweise werden Mikrokapillarglasnadeln durch Erhitzen von Glas bis zu dem Punkt gezogen, an dem das Glas elastisch wird, wodurch die Kapillare in eine sich verjüngende Nadel mit geschlossener Spitze gezogen werden kann. Bevor die Nadel verwendet werden kann, muss sie so geöffnet werden, dass eine scharfe Spitze für die Injektion entsteht. Traditionell werden Nadeln geöffnet, indem man die Nadelspitze vorsichtig gegen etwas streicht (den Rand eines Objektträgers/Deckglases oder den Embryo usw.), das dazu führt, dass eine kleine Menge Glas von der Spitze abbricht, wodurch zufällig eine scharfe Spitze entsteht ^2,3. Ein etwas weniger zufälliges Verfahren ist das Trockenfasen, bei dem die Nadel schnell für kurze Zeit auf eine optisch flache, sich drehende Schleifplatte abgesenkt wird, wodurch eine kleine Menge Glas von der Nadelspitze abgerieben wird, wodurch eine scharfe Spitze entsteht. Das Trockenfasen ist etwas weniger zufällig als das Bürsten der Nadelspitze gegen etwas. Das im Folgenden beschriebene Protokoll geht noch einen Schritt weiter, indem es die abzuschrägende Nadel mit Druckluft versorgt und sie unter einer Flüssigkeitsschicht abschrägt, so dass Blasen sichtbar sind, sobald die Nadel geöffnet wurde. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung zuverlässig scharfer Mikroinjektionsnadeln. Das Anfasen unter einer Flüssigkeitsschicht ist eine Verbesserung gegenüber dem zufälligen Brechen der Nadel, wie oben beschrieben, und dem trockenen Anfasen, da der Benutzer eine Rückmeldung über den Anfasvorgang erhält, so dass die Person, die anfaselt, weiß, wann die Nadel offen ist und wie groß die Nadelöffnung relativ ist. Wenn die relative Öffnungsgröße der Nadelspitze bekannt ist, kann die Person, die die Nadel abschrägt, Nadeln mit unterschiedlichen Öffnungsgrößen herstellen. Verschiedene Nadelöffnungsgrößen haben unterschiedliche Vorteile; Zum Beispiel können größere Nadelöffnungen Injektionsmischungen mit hoher Viskosität aufnehmen, während kleinere Öffnungsnadeln den zu injizierenden Embryo weniger schädigen.

Die Luftzufuhr zur Nadel erfolgt über einen Regler und ein System von Urethanschläuchen, das auf einem modifizierten luftdruckgeregelten Einspritzsystem² basiert. Während die Nadel mit konstantem Druck mit Luft versorgt wird, wird die Nadel unter einer Flüssigkeitsschicht abgeschrägt. Der Anfasprozess besteht aus einem sich wiederholenden fünfstufigen Prozess: 1) Absenken der Nadel auf die Schleiffläche, 2) Abschrägen der Nadel für einen kurzen Zeitraum, 3) Anheben der Nadel von der Schleifplatte, während sie unter der Oberfläche der Flüssigkeitsschicht gehalten wird, 4) Stoppen der Drehung der Schleifplatte, um das Auftreten von Blasen zu überprüfen. Wenn keine Blasen vorhanden sind, werden die Schritte 1 bis 4 wiederholt, bis Blasen erscheinen. 5) Sobald Blasen vorhanden sind, kann der Luftdruck angepasst werden, um die relative Öffnungsgröße der Nadel zu bestimmen. Je geringer der Druck ist, der erforderlich ist, um die Blasenbildung zu stoppen, desto größer ist die Öffnung an der Nadelspitze.

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll, wie unten beschrieben, verwendet die abgeschrägte Sutter BV-10 Mikrokapillare. Dieses Protokoll kann jedoch für die Verwendung mit jedem Modell mit abgeschrägten Mikrokapillaren modifiziert werden.

1. Montage von Regler, Manometer und Luftzufuhrschlauch

1. Schneiden Sie einen Abschnitt des Urethanschlauchs für die Verbindung von der Luftzufuhr zur Basis des Reglers ab (R; Abschnitt 1, Abbildung 1). Die Länge dieses Abschnitts hängt vom Abstand zwischen der Luftzufuhr und dem Regler ab, der sich neben dem Anfaser befindet.
2. Schieben Sie eine Schlauchschelle auf den Urethanschlauch und schieben Sie dann einen Schlauchanschluss in das Ende des Schlauchs. Stellen Sie sicher, dass der Schlauchanschluss vollständig eingesteckt ist, indem Sie den Schlauchanschluss auf eine harte Oberfläche legen. Halten Sie den Schlauch nahe am Schlauchanschluss fest und drücken Sie den Schlauch fest in den Schlauch, bis der Schlauchanschluss vollständig eingesteckt ist. Zusammen bilden Schlauchschelle und Schlauchanschluss den Anschluss HC (Bild 1).
3. Schieben Sie die Schlauchschelle bis zum Ende des Schlauchs, wo der Schlauchanschluss eingeführt ist. Drehen Sie die Schlauchschelle über das eingesetzte Widerhakenende, so dass sie eine luftdichte Verbindung bildet.
4. Schrauben Sie den Schlauchanschluss von Hand in die Basis des Reglers (R) und ziehen Sie die Verbindung dann mit einem kleinen Schraubenschlüssel fest. Stellen Sie sicher, dass die Verbindung luftdicht, aber nicht zu fest ist.
5. Schrauben Sie in den seitlichen Anschluss des Reglers von Hand einen T-Verbinder (T) ein und verwenden Sie dann einen kleinen Schraubenschlüssel, um den Festzug abzuschließen.
6. Schneiden Sie ein kleines Stück Urethanschlauch (Abbildung 1, Abschnitt 2) mit einer Länge von ca. 3-5 cm ab. Setzen Sie zwei Schlauchschellen auf das Schlauchstück, stecken Sie dann einen Schlauchverbinder in jedes Ende des Schlauchs und beenden Sie die Anschlüsse (HC) wie in den Schritten 1.2-1.4 für jedes Ende des Schlauches beschrieben.
7. Schrauben Sie ein Ende des kurzen Schlauches in den Boden des Manometers und ziehen Sie es dann mit einem Schraubenschlüssel wie in Schritt 1.5 fest.
8. Schrauben Sie das andere Ende des kurzen Schlauches in einen der Anschlüsse am T-Stecker (T), der in Schritt 1.5 mit dem Regler verbunden ist.
9. Schneiden Sie einen Abschnitt des Urethanschlauchs (Abbildung 1, Abschnitt 3) für die Verbindung zwischen dem Atemregler und dem Nadelhalter (NH) ab. Die Größe dieses Abschnitts hängt von der Entfernung zwischen dem Anfaser und der Position des Reglers ab.
10. Setzen Sie eine Schlauchschelle auf das Schlauchstück und setzen Sie dann einen Schlauchanschluss ein, wie in den Schritten 1.2-1.4 beschrieben.
11. Platzieren Sie auf der anderen Seite dieses Schlauchabschnitts die Luer-Buchse (LC), die mit dem Nadelhalter (NH) geliefert wird.
12. Entfernen Sie die Halteklammer und die Nylonscheibe (Abbildung 2, f) vom Manipulator. Die Halteklammer und die Unterlegscheibe sind nur für die Aufnahme einer Glasmikrokapillare ausgelegt, sie sind nicht für das zusätzliche Gewicht eines Mikrokapillarhalters, einer Gewindestange und eines Luftzufuhrschlauchs ausgelegt.
13. Schneiden Sie ein rechteckiges Stück Gummipackblatt von 1,5 cm x 2 cm ab, um die Gewindestange in die Schutzblechklemme des Fahrrads einzuwickeln. Dies hilft dabei, die Gewindestange und den Nadelhalter sicherer in der Schutzblechklemme des Fahrrads zu halten. Öffnen Sie mit zwei Spitzzangen den Fahrradschutzblechclip, falten Sie das rechteckige Stück Gummipackblatt 3,5 cm von einem Ende der Stange entfernt über die Gewindestange, so dass es ein U über der Stange bildet. Stecken Sie die mit einer Gummifolie ummantelte Gewindestange in die geöffnete Fahrradschutzblechklemme und schließen Sie die Klemme mit der Zange um die Stange und die Gummiplatte. Montieren Sie die Fahrradklemme und die Gewindestangenbaugruppe an der Manipulatorschraube, ersetzen Sie die Halteschelle ohne die Nylonscheibe und ziehen Sie die Halteklammer fest, bis sie die Gewindestangenbaugruppe sicher hält.
14. Fädeln Sie den Nadelhalter auf die Gewindestange. Stellen Sie sicher, dass der Luer-Anschluss in einer Position endet, die den Urethanschlauch beim Anschließen nicht einklemmt (Abbildung 2, g).
15. Verbinden Sie die Luer-Buchse mit der Luer-Buchse (Abbildung 2, g) des Nadelhalters (Abbildung 2, d).
16. Verbinden Sie das freie Ende des Rohrs in Abbildung 1, Abschnitt 1 mit der Luftzufuhr (diese Verbindung variiert je nach verwendeter Luftzufuhr). Die Luftzufuhr sollte sauber, trocken und frei von Ölrückständen sein. Die Luftzufuhr kann aus einer Hausluftquelle oder einer Gasflasche erfolgen, entweder aus Druckluft oder Stickstoff.

2. Anfasen von Borosilikatnadeln

1. Ziehen Sie Mikroinjektionsnadeln mit Mikrokapillaren aus Borosilikatglas mit den folgenden Einstellungen am Instrument: Wärme: 305, Fil: 4, Vel: 70, Entf: 235, Pul: 160, mit einer Schleifenzeit von 12,24.
2. Die Schleifanordnung, bestehend aus der Schleifplatte und dem Sicherungsring mit Magneten¹², wird nach Herstellerangaben montiert.
   HINWEIS: Die Schleifplatte muss möglicherweise mit einem dünnen Streifen transparenter Folie umwickelt werden, um ein vorzeitiges Austreten von Photo-Flo (Netzmittel) aus der Schleifplatte zu verhindern. Dies ist nur dann erforderlich, wenn die Netzmittellösung vorzeitig in das Sockelöl austritt und der Mahlteller sich nicht mehr dreht. Das Netzmittel reduziert das Risiko von Trocknungsspuren auf den Glasnadeln nach dem Anfasen. Die Verwendung eines Netzmittels ist für den Anfasprozess nicht kritisch, und Wasser kann substituiert werden.
3. Geben Sie 10 Tropfen Sockelöl auf die optisch ebene Oberfläche des Sockels und setzen Sie die Schleifgarnitur darauf. Starten Sie die Schleifmontage.
4. Schalten Sie die Lichtquelle ein, um die Oberfläche zu beleuchten. Stellen Sie sicher, dass die Lichtquelle hinter der Fase positioniert ist und in einem Winkel von 45° zur Schleifplatte und Nadel scheint. Der Beleuchtungswinkel ist notwendig, damit ein Schatten der Nadel gut zu erkennen ist. Drehen Sie den Mikroskopkopf bei 90-facher Vergrößerung in Position. Stoppen Sie kurzzeitig das Drehen der Schleifplatte und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche der Schleifplatte.
5. Geben Sie 1 % Netzmittel in den Docht, bis der Docht vollständig nass ist. Geben Sie 1 % Netzmittel auf die Oberfläche der Schleifplatte. Stellen Sie sicher, dass das Netzmittel die abrasive Oberfläche bedeckt, aber nicht auf den schwarzen Sicherungsring austritt.
6. Legen Sie den vornassen Docht während des Drehens auf die Oberfläche der Schleifplatte. Stellen Sie sicher, dass sich der Docht auf der linken Seite der Schleifplatte befindet (wenn Sie von oben nach unten schauen) und sich von 11 Uhr bis 6 Uhr erstreckt (mit der Platte als Zifferblatt). Stellen Sie sicher, dass der Docht nicht auf dem schwarzen Teil des Sicherungsrings sitzt.
7. Führen Sie eine Nadel in den Nadelhalter ein (Abbildung 2, d) und ziehen Sie den Sicherungsring fest, um die Nadel an Ort und Stelle zu halten. Öffnen Sie den Regler (Abbildung 1, R) und erhöhen Sie den Druck auf 24 psi.
8. Heben Sie den Nadelhalter an, indem Sie den Kurseinstellknopf drehen (Abbildung 2, a). Stellen Sie sicher, dass die Nadel hoch genug angehoben ist, dass sie höher als die Oberfläche der rotierenden Schleifplatte ist, und drehen Sie dann den gesamten Manipulator so, dass die Nadel über der rotierenden Schleifplatte in Position schwingt. Die abzuschrägende Nadel sollte so auf die rotierende Schleifplatte gelegt werden, dass sich die Drehung der Platte von der Nadelspitze weg bewegt (Abbildung 3A)
9. Von der Seite beobachtend, senken Sie die Nadel mit dem groben Einstellknopf (Abbildung 2, a) in Richtung der Schleifplattenoberfläche ab. Stoppen Sie, wenn die Nadel fast die Oberfläche der Flüssigkeit berührt.
10. Verwenden Sie den Zoom, um die Vergrößerung des Mikroskops zu verringern, und bewegen Sie das Mikroskop dann so, dass sich die Nadel in der Mitte des Sichtfelds befindet. Sobald Sie sich in der Mitte des Bildes befinden, erhöhen Sie die Vergrößerung und passen Sie die Position des Manipulators so an, dass die Nadelspitze in der Bildmitte bleibt. Sobald die maximale Vergrößerung erreicht ist, stoppen Sie die Schleifplatte und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche der Schleifplatte, dann starten Sie sofort die Drehung der Platte, sobald die Oberfläche scharf gestellt ist. Die Nadel ist zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nicht zu sehen.
11. Senken Sie die Nadel mit dem Grobeinstellknopf des Manipulators in Richtung der Schleifplatte ab. Im Sichtfeld sind ein Bild der Nadel und ein oder mehrere Schatten der Nadel zu sehen. Wenn sich die Nadel und der/die Schatten der Nadel fast berühren, wechseln Sie zum Feineinstellknopf des Manipulators und senken Sie die Nadel weiter, bis sich die Nadel und ihr(e) Schatten(e) zu berühren scheinen. Lesen Sie an dieser Stelle den Messschieber ab (Abbildung 2, c) und notieren Sie sich den Messwert. Die Oberfläche der Schleifplatte befindet sich bei oder unter diesem Messwert.
    HINWEIS: Es ist schwer zu erkennen, wann die Nadel die Oberfläche der rotierenden Schleifplatte berührt, so dass die Nadel die Schleifplatte zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nicht berührt.
12. Lassen Sie die Nadel 5-10 s lang auf diesem Messwert des Messschiebers.
13. Heben Sie die Nadel mit dem Feineinstellknopf des Manipulators an und achten Sie darauf, dass sie unter der Oberfläche des Netzmittels bleibt. Stoppen Sie die Drehung der Schleifplatte für einige Sekunden und beobachten Sie, ob Blasen aus der Nadelspitze austreten. Wenn Blasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 2.15 fort. Wenn keine Blasen vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 2.14 fort.
14. Bewegen Sie die Nadel mit dem Feineinstellknopf des Manipulators zurück auf den Messschieber, bewegen Sie sie dann etwas tiefer und nehmen Sie einen neuen Messschieber vor, dann wiederholen Sie die Schritte 2.12-2.13.
15. Starten Sie die Schleifplatte erneut, um zu sehen, ob Blasenbildung zu beobachten ist, während sich die Platte dreht. Wenn während der Plattenrotation Anzeichen von Blasenbildung sichtbar sind, ist die Öffnung der Nadelspitze wahrscheinlich zu groß für empfindliche Mikroinjektionen von Embryonen, wie z. B. Injektionen von Mückenembryonen. Wenn die Blasenbildung während der Drehung der Schleifplatte nicht sichtbar ist, ist die Nadelöffnung ideal für den Einsatz bei Verfahren, die eine scharfe und kleine Öffnungsnadel erfordern.
16. Verwenden Sie den Kurseinstellknopf des Manipulators, um die Nadel über die Schleifplatte in eine Position zu bringen, die hoch genug über der Platte liegt, dass die Nadel nichts trifft, wenn der gesamte Manipulator gedreht wird, um die Nadel von der Schleifplatte und dem Mikroskop weg zu bewegen.
17. Sobald sich die Nadel in einer Position befindet, in der sie entfernt werden kann, ohne etwas zu treffen, senken Sie den Luftdruck auf Null, entfernen Sie die Nadel und legen Sie sie bis zum Gebrauch in eine Nadelaufbewahrungsbox (eine Petrischale mit entweder Doppelklebeband oder Modelliermasse, um die abgeschrägten Nadeln zu halten).

3. Bestimmung der relativen Öffnungsgröße der abgeschrägten Nadel

HINWEIS: Die Bestimmung der relativen Öffnungsgrößen der abgeschrägten Nadel erfolgt in Schritt 2.13. In den folgenden Schritten wird dieser Vorgang näher beschrieben.

1. Sobald in Schritt 2.13 Blasen beobachtet werden und sich die Schleifplatte nicht dreht, verringern Sie langsam den Luftdruck, indem Sie den Einstellknopf des Reglers (Abbildung 1, R) drehen, bis keine Blasen mehr aus der Nadelspitze fließen. Beachten Sie den Druck, bei dem die Blasen nicht mehr aus der Spitze fließen.
2. Erhöhen Sie den Luftdruck, bis wieder Blasen aus der Nadelspitze fließen. Je höher der Druck, desto kleiner die Öffnung der Nadel.
3. Fahren Sie fort, indem Sie die Nadel in eine Position bringen, in der sie sicher entfernt werden kann, Schritte 2.16-2.17.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Verfahren erzeugt gleichbleibend scharfe Mikroinjektionsnadeln. Scharfe Nadeln zeichnen sich dadurch aus, dass sie in der Lage sind, weiche Chorion-Insektenembryonen, wie z. B. Mückenembryonen, mit wenig bis gar keinem Widerstand der Embryonalmembran einzuführen. Wenn Mückenembryonen zur genetischen Veränderung mikroinjiziert werden, ist die Embryonalmembran relativ elastisch. Wenn Sie eine stumpfe Nadel gegen die Embryonalmembran drücken, wird sie eingedrückt...

Diskussion

Die genetische Modifikation von Stechmücken beruht auf einer präzisen Mikroinjektion der Modifikationsmaterialien (Plasmide, Leit-RNAs oder Proteine) in Prä-Blastoderm-Embryonen 3,4,5,6,7,8. Entscheidend für diesen Prozess sind scharfe Nadeln, die den Embryo während der Injektion leicht ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050