Nassanfasen von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck zur Rückmeldung der Nadelöffnung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Montage eines pneumatischen Systems zur Abgabe von Druckluft an eine Nadel während des Prozesses des Anfasens der Nadel. Das Protokoll beschreibt ferner den Anfasprozess zur Herstellung scharfer Mikroinjektionsnadeln und wie die relative Öffnungsgröße der Nadel gemessen wird.

Zusammenfassung

Mikroinjektionsnadeln sind ein wichtiges Werkzeug bei der Verabreichung von Reagenzien zur Genommodifikation, CRISPR-Komponenten (Guide-RNAs, Cas9-Protein und Donor-Template) und Komponenten des Transposon-Systems (Plasmide und Transposase-mRNA) in sich entwickelnde Insektenembryonen. Scharfe Mikroinjektionsnadeln sind bei der Verabreichung dieser Modifikationsmittel besonders wichtig, da sie dazu beitragen, Schäden am zu injizierenden Embryo zu minimieren und dadurch das Überleben dieser Embryonen im Vergleich zur Injektion mit nicht abgeschrägten Nadeln zu erhöhen. Darüber hinaus erzeugt das Abschrägen von Nadeln Nadeln, die von Nadel zu Nadel konsistenter sind, verglichen mit Nadeln, die durch zufälliges Brechen der Nadelspitze geöffnet werden, indem die Spitze gegen ein Objekt gestreift wird (Seite eines Deckglases, die Oberfläche des zu injizierenden Embryos usw.). Das Verfahren des Nassanfasens von Mikroinjektionsnadeln mit konstantem Luftdruck, die der Nadel zugeführt wird, ermöglicht es der Person, die die Nadel anfas, zu wissen, wann die Nadel offen ist (Vorhandensein von Blasen) und gibt auch einen relativen Hinweis darauf, wie groß eine Nadelöffnung entstanden ist. Die relative Öffnungsgröße in der Nadel kann bestimmt werden, indem der an die Nadel abgegebene Luftdruck angepasst wird, bis ein Gleichgewicht erreicht ist und keine Blasen mehr aus der Nadelspitze fließen. Je niedriger der Druck ist, bei dem das Gleichgewicht erreicht wird, desto größer ist die Nadelstärke; Und umgekehrt gilt: Je höher der Druck, desto kleiner die Nadelstärke.

Einleitung

Die genetische Modifikation von Insekten ist ein Verfahren, das ursprünglich von Rubin und Spradling in Drosophila entwickelt wurde und im Laufe der Jahre modifiziert wurde, um genetische Veränderungen bei anderen Arten^{zu erzeugen 1}. Der Prozess beruht auf der präzisen Abgabe von Modifikationskomponenten, die in einem bestimmten Zeit- und Ortsfenster innerhalb des sich entwickelnden Embryos mikroinjiziert werden ^2,3,4. Scharfe Mikroinjektionsnadeln sind ein wichtiges Werkzeug im Prozess der genetischen Veränderung eini....

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll, wie unten beschrieben, verwendet die abgeschrägte Sutter BV-10 Mikrokapillare. Dieses Protokoll kann jedoch für die Verwendung mit jedem Modell mit abgeschrägten Mikrokapillaren modifiziert werden.

1. Montage von Regler, Manometer und Luftzufuhrschlauch

1. Schneiden Sie einen Abschnitt des Urethanschlauchs für die Verbindung von der Luftzufuhr zur Basis des Reglers ab (R; Abschnitt 1, Abbildung 1). Die Länge dieses Abschnitts hängt vom Abstand zwischen der Luftzufuhr und dem Regler ab, der sich neben dem Anfaser befindet.

Ergebnisse

Das oben beschriebene Verfahren erzeugt gleichbleibend scharfe Mikroinjektionsnadeln. Scharfe Nadeln zeichnen sich dadurch aus, dass sie in der Lage sind, weiche Chorion-Insektenembryonen, wie z. B. Mückenembryonen, mit wenig bis gar keinem Widerstand der Embryonalmembran einzuführen. Wenn Mückenembryonen zur genetischen Veränderung mikroinjiziert werden, ist die Embryonalmembran relativ elastisch. Wenn Sie eine stumpfe Nadel gegen die Embryonalmembran drücken, wird sie eingedrückt.......

Diskussion

Die genetische Modifikation von Stechmücken beruht auf einer präzisen Mikroinjektion der Modifikationsmaterialien (Plasmide, Leit-RNAs oder Proteine) in Prä-Blastoderm-Embryonen 3,4,5,6,7,8. Entscheidend für diesen Prozess sind scharfe Nadeln, die den Embryo während der Injektion leicht .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050