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이 프로토콜은 니들 베벨링 과정에서 니들에 가압된 공기를 전달하기 위한 공압 시스템의 조립을 설명합니다. 이 프로토콜은 날카로운 미세 주입 바늘을 만들기 위한 베벨링 공정과 바늘의 상대적인 개구부 크기를 측정하는 방법을 추가로 설명합니다.
미세주사 바늘은 게놈 변형 시약, CRISPR 구성 요소(가이드 RNA, Cas9 단백질 및 기증자 템플릿) 및 트랜스포존 시스템 구성 요소(플라스미드 및 트랜스포사제 mRNA)를 곤충 배아 발달에 전달하는 데 중요한 도구입니다. 날카로운 미세주사 바늘은 주입되는 배아의 손상을 최소화하는 데 도움이 되어 비스듬하지 않은 바늘로 주입하는 것에 비해 이러한 배아의 생존을 증가시키기 때문에 이러한 변형제의 전달 중에 특히 중요합니다. 또한, 바늘의 경사지는 바늘 끝을 물체(커버슬립의 측면, 주입할 배아의 표면 등)에 대고 바늘 끝을 무작위로 부러뜨려 열린 바늘에 비해 바늘에서 바늘로 더 일관된 바늘을 생성합니다. 바늘에 일정한 압력의 공기가 전달되는 미세 주입 바늘의 습식 베벨링 과정을 통해 바늘을 베벨 처리하는 사람은 바늘이 열려 있을 때(기포가 있음) 알 수 있으며 바늘 구멍이 얼마나 크게 만들어졌는지에 대한 상대적인 표시도 제공합니다. 바늘의 상대적인 개구부 크기는 평형에 도달하고 바늘 끝에서 기포가 흐르지 않을 때까지 바늘에 전달되는 공기 압력을 조정하여 결정할 수 있습니다. 평형에 도달하는 압력이 낮을수록 바늘 크기가 커집니다. 반대로 압력이 높을수록 바늘 크기가 작아집니다.
곤충 유전자 변형은 원래 루빈(Rubin)과 스프래들링(Spradling)에 의해 초파리(Drosophila)에서 개발된 과정이며, 수년에 걸쳐 이 과정이 수정되어 다른 종에서도 유전자 변형을 생성했다1. 이 과정은 발달 중인 배아 2,3,4 내의 특정 시간 및 위치에서 배아에 미세주입된 변형 성분의 정확한 전달에 의존합니다. 날카로운 미세주사 바늘은 모기 4,5,6,7,8,9 및 모래파리10와 같은 일부 곤충의 유전자 변형 과정에서 중요한 도구이지만, 누에11와 같은 다른 곤충에게는 그다....
알림: 아래 설명된 프로토콜은 Sutter BV-10 미세모세관 베벨을 사용합니다. 그러나 이 프로토콜은 경사진 모든 모델의 미세모세관과 함께 사용하도록 수정할 수 있습니다.
1. 레귤레이터, 압력계, 공기 공급 튜브의 조립
위에서 설명한 절차는 일관되게 날카로운 미세 주입 바늘을 생성합니다. 날카로운 바늘은 모기 배아와 같은 부드러운 융모막 곤충 배아에 배아 막의 저항이 거의 또는 전혀 없이 삽입할 수 있는 것이 특징입니다. 유전자 변형을 위해 모기 배아를 미세 주입하면 배아막은 상대적으로 탄력이 있습니다. 무딘 바늘을 배아막에 밀어 넣으면 움푹 들어간 곳이 생깁니다(
모기의 유전자 변형은 변형 물질(플라스미드, 가이드 RNA 또는 단백질)을 배배엽 이전 배아 3,4,5,6,7,8에 정밀하게 미세주입하는 데 의존합니다. 이 과정에 중요한 것은 주입 중에 배아를 쉽게 관통하는 날카로운 바늘입니다
저자는 밝힐 것이 없습니다.
저자는 다음과 같은 사람들에게 감사의 뜻을 전하고 싶습니다. 메릴랜드 대학교 곤충 변형 시설 직원: Channa Aluvihare, Robert Alford 및 Daniel Gay. 그들의 헌신적인 노력이 없었다면 곤충 변형 시설은 존재하지 않았을 것입니다. 이 원고를 교정해 준 Vanessa Meldener-Harrell.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.0 mm O.D. microcapillaries | World Precision Instruments | ||
Beveler pedestal oil | Sutter Instruments | 008 | |
Bicycle fender clip | VeloOrange | R-clip 4-pack | https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack |
Boom Stand Microscope | AmScope | AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent | |
BV-10 Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
Diamond abrasive plate | Sutter Instruments | 104F | Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes) |
Gasket, Buna-N | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 11761-2-pkg | Used to seal connection on T or L connectors, if not already included with these pieces |
Hose Clamp | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 5000-2-pkg | |
Hose connector | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | CT4-pkg | Need 5 hose connectors |
Microinjection Needle Holder | World Precision Instruments | MPH3-10 | Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries |
P-2000 | Sutter Instruments | Any needle puller | |
Photo-Flo 200 Solution | B&H Photo, Video and Audio | BH #KOPF200P MFR #1464510 | wetting agent |
Pressure Gauge | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | PG-100 | 0-100 psi gauge |
Reference wick | Sutter Instruments | X050300 | |
Reference wick holder | Sutter Instruments | M100019 | |
Regulator | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 01-Mar | Need #10-32 ports for connections |
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in | Danco | Model # 59849 | |
T fitting | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 15002-2-pkg | |
Threaded Bar | Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32. | ||
Urethane tubing | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | URH1-0804-BLT-050 |
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