바늘 개방에 대한 피드백을 위해 일정한 공기 압력을 사용하는 미세 주입 바늘의 습식 베벨링

요약

이 프로토콜은 니들 베벨링 과정에서 니들에 가압된 공기를 전달하기 위한 공압 시스템의 조립을 설명합니다. 이 프로토콜은 날카로운 미세 주입 바늘을 만들기 위한 베벨링 공정과 바늘의 상대적인 개구부 크기를 측정하는 방법을 추가로 설명합니다.

초록

미세주사 바늘은 게놈 변형 시약, CRISPR 구성 요소(가이드 RNA, Cas9 단백질 및 기증자 템플릿) 및 트랜스포존 시스템 구성 요소(플라스미드 및 트랜스포사제 mRNA)를 곤충 배아 발달에 전달하는 데 중요한 도구입니다. 날카로운 미세주사 바늘은 주입되는 배아의 손상을 최소화하는 데 도움이 되어 비스듬하지 않은 바늘로 주입하는 것에 비해 이러한 배아의 생존을 증가시키기 때문에 이러한 변형제의 전달 중에 특히 중요합니다. 또한, 바늘의 경사지는 바늘 끝을 물체(커버슬립의 측면, 주입할 배아의 표면 등)에 대고 바늘 끝을 무작위로 부러뜨려 열린 바늘에 비해 바늘에서 바늘로 더 일관된 바늘을 생성합니다. 바늘에 일정한 압력의 공기가 전달되는 미세 주입 바늘의 습식 베벨링 과정을 통해 바늘을 베벨 처리하는 사람은 바늘이 열려 있을 때(기포가 있음) 알 수 있으며 바늘 구멍이 얼마나 크게 만들어졌는지에 대한 상대적인 표시도 제공합니다. 바늘의 상대적인 개구부 크기는 평형에 도달하고 바늘 끝에서 기포가 흐르지 않을 때까지 바늘에 전달되는 공기 압력을 조정하여 결정할 수 있습니다. 평형에 도달하는 압력이 낮을수록 바늘 크기가 커집니다. 반대로 압력이 높을수록 바늘 크기가 작아집니다.

서문

곤충 유전자 변형은 원래 루빈(Rubin)과 스프래들링(Spradling)에 의해 초파리(Drosophila)에서 개발된 과정이며, 수년에 걸쳐 이 과정이 수정되어 다른 종에서도 유전자 변형을 생성했다¹. 이 과정은 발달 중인 배아 ^2,3,4 내의 특정 시간 및 위치에서 배아에 미세주입된 변형 성분의 정확한 전달에 의존합니다. 날카로운 미세주사 바늘은 모기 4,5,6,7,8,9 및 모래파리10와 같은 일부 곤충의 유전자 변형 과정에서 중요한 도구이지만, 누에¹¹와 같은 다른 곤충에게는 그다지 중요하지 않다. 날카로운 바늘은 종종 유전자 변형 곤충을 만들려고 할 때 성공과 실패를 가르는 핵심 요소입니다 ^2,4. 일반적으로 미세 모세관 유리 바늘은 유리가 탄성이 생기는 지점까지 유리를 가열하여 당겨 모세관을 점점 가늘어지는 닫힌 팁 바늘로 당길 수 있습니다. 바늘을 사용하기 전에 주입을 위한 날카로운 팁을 만드는 방식으로 바늘을 열어야 합니다. 전통적으로 바늘은 바늘 끝을 무언가(슬라이드/커버슬립의 가장자리 또는 배아 등)에 부드럽게 문질러 팁에서 소량의 유리가 떨어져 나가 무작위로 날카로운 팁 ^2,3을 생성하여 엽니다. 약간 덜 무작위적인 과정은 건식 베벨링으로, 바늘을 짧은 시간 동안 광학적으로 평평하고 회전하는 연마판 위로 빠르게 내려 바늘 끝에서 소량의 유리가 마모되어 날카로운 팁을 만듭니다. 드라이 베벨링은 바늘 끝을 무언가에 문지르는 것보다 약간 덜 무작위적입니다. 아래에 설명된 프로토콜은 베벨링되는 바늘에 압축 공기를 공급하고 바늘이 열리자마자 기포가 보이도록 액체 층 아래로 경사지게 함으로써 베벨링 프로세스를 한 단계 더 발전시킵니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있고 날카로운 미세 주입 바늘을 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 액체 층 아래의 베벨링은 위에서 설명한 것처럼 바늘을 무작위로 부러뜨리는 것보다 개선되었으며, 사용자가 베벨링 프로세스에 대한 피드백을 받기 때문에 베벨링하는 사람이 바늘이 언제 열려 있는지, 바늘 개구부가 상대적으로 얼마나 큰지 알 수 있습니다. 바늘 끝의 상대적인 개구부 크기를 알면 베벨링하는 사람이 다양한 개구부 크기를 가진 바늘을 만들 수 있습니다. 다양한 바늘 개구부 크기에는 다른 장점이 있습니다. 예를 들어, 바늘 개구부 크기가 클수록 점도가 높은 주입 혼합물을 수용할 수 있는 반면, 작은 개구부 바늘은 주입되는 배아에 대한 손상을 줄일 수 있습니다.

공기는 조절기와 수정 된 공기 압력 조절 주입 시스템⁽²)을 기반으로하는 우레탄 튜브 시스템을 사용하여 바늘에 공급됩니다. 공기가 일정한 압력으로 바늘에 공급되는 동안 바늘은 액체 층 아래에서 비스듬합니다. 베벨링 공정은 1) 바늘을 연마 표면으로 내리고, 2) 바늘을 짧은 시간 동안 경사지게 하고, 3) 바늘을 액체 층의 표면 아래에 유지하면서 연마판에서 바늘을 들어 올리고, 4) 연마판의 회전을 중지하여 기포가 나타나는지 확인하는 5단계 반복 공정으로 구성됩니다. 거품이 없으면 거품이 나타날 때까지 1-4단계가 반복됩니다. 5) 기포가 나타나면 공기 압력을 조정하여 바늘의 상대적인 개구부 크기를 결정할 수 있습니다. 기포 형성을 막는 데 필요한 압력이 낮을수록 바늘 끝의 개구부가 커집니다.

프로토콜

알림: 아래 설명된 프로토콜은 Sutter BV-10 미세모세관 베벨을 사용합니다. 그러나 이 프로토콜은 경사진 모든 모델의 미세모세관과 함께 사용하도록 수정할 수 있습니다.

1. 레귤레이터, 압력계, 공기 공급 튜브의 조립

1. 공기 공급 장치에서 레귤레이터 바닥까지 연결하기 위해 우레탄 튜브 부분을 자릅니다(R; 섹션 1, 그림 1). 이 섹션의 길이는 공기 공급 장치에서 베벨러 옆에 위치할 레귤레이터까지의 거리에 따라 달라집니다.
2. 호스 cl을 밀어 넣습니다.amp 우레탄 튜브에 끼운 다음 호스 커넥터를 튜브 끝에 밀어 넣습니다. 호스 커넥터를 단단한 표면에 대고 호스 커넥터가 완전히 삽입되었는지 확인하십시오. 튜브를 호스 커넥터 가까이에 대고 호스 커넥터가 완전히 삽입될 때까지 튜브를 호스에 단단히 누릅니다. 호스 클램프와 호스 커넥터는 함께 연결 HC를 형성합니다(그림 1).
3. 호스 cl을 밀어amp 호스 커넥터가 삽입되는 튜브 끝까지 올라갑니다. 호스 cl을 회전amp 삽입된 미늘 끝 위로 기밀 연결을 형성합니다.
4. 호스 커넥터를 레귤레이터(R) 바닥에 손으로 나사로 고정한 다음 작은 렌치로 연결을 조입니다. 연결이 밀폐되어 있지만 너무 빡빡하지 않은지 확인하십시오.
5. 레귤레이터의 측면 포트에서 T 커넥터(T)를 손으로 조인 다음 작은 렌치를 사용하여 조임을 마칩니다.
6. 약 3-5cm 길이의 작은 우레탄 튜브 조각(그림 1, 섹션 2)을 자릅니다. 두 개의 호스 cl을 놓습니다.amp 튜브 조각에 s를 놓은 다음 튜브의 양쪽 끝에 호스 커넥터를 삽입하고 튜브의 각 끝에 대해 1.2-1.4단계에 설명된 대로 연결(HC)을 완료합니다.
7. 짧은 튜브의 한쪽 끝을 압력계 바닥에 나사로 고정한 다음 1.5단계와 같이 렌치로 조입니다.
8. 짧은 튜브의 다른 쪽 끝을 1.5단계에서 레귤레이터에 연결된 T 커넥터(T)의 포트 중 하나에 나사로 고정합니다.
9. 레귤레이터와 바늘 홀더(NH) 사이의 연결을 위해 우레탄 튜브 섹션(그림 1, 섹션 3)을 자릅니다. 이 섹션의 크기는 베벨러에서 레귤레이터 위치까지의 거리에 따라 다릅니다.
10. 호스 cl을 놓으십시오.amp 튜브 섹션에 놓은 다음 1.2-1.4단계에 설명된 대로 호스 커넥터를 삽입합니다.
11. 이 튜브 섹션의 다른 쪽에는 바늘 홀더(NH)와 함께 제공된 암 루어 커넥터(LC)를 놓습니다.
12. 고정 cl 제거amp 매니퓰레이터에서 나일론 와셔(그림 2, f)를 제거합니다. 고정 클램프와 와셔는 유리 미세모세관만 고정하도록 설계되었으며 미세모세관 홀더, 나사산 막대 및 공기 공급 튜브의 추가 무게를 지탱하도록 설계되지 않았습니다.
13. 직사각형 고무 포장 시트 조각을 1.5cm x 2cm 크기로 잘라 나사산 막대를 자전거 펜더 클램프에 감쌉니다. 이렇게 하면 나사산 막대와 바늘 홀더를 자전거 펜더 클램프에서 더 안전하게 고정하는 데 도움이 됩니다. 두 개의 바늘 코 플라이어를 사용하여 자전거 펜더 클립을 열고 막대의 한쪽 끝에서 3.5cm 떨어진 나사산 막대 위에 직사각형 고무 포장 시트 조각을 접어 막대 위에 U를 형성하도록 합니다. 고무 시트로 덮인 나사산 막대를 열린 자전거 펜더 클램프에 삽입하고 플라이어를 사용하여 클램프를 닫습니다.amp 막대와 고무 시트 주위. 자전거 cl 설치 clamp 매니퓰레이터 볼트에 나사산 막대 어셈블리를 놓고 고정 cl을 교체하십시오.amp 나일론 와셔가 없는 경우 나사산 막대 어셈블리를 단단히 고정할 때까지 고정 clamp.
14. 바늘 홀더를 나사산 막대에 끼웁니다. 루어 커넥터가 연결될 때 우레탄 튜브를 묶지 않는 위치에서 끝나는지 확인하십시오(그림 2, g).
15. 암 루어 커넥터를 바늘 홀더(그림 2, d)의 수 루어 커넥터(그림 2, g)에 연결합니다.
16. 그림 1, 섹션 1 튜브의 다른 쪽 끝을 공기 공급 장치에 연결합니다(이 연결은 사용되는 공기 공급 장치에 따라 다름). 공기 공급은 깨끗하고 건조한 공기여야 하며 오일 잔류물이 없어야 합니다. 공기 공급은 가정용 공기 공급원 또는 가스 실린더(압축 공기 또는 질소)에서 얻을 수 있습니다.

2. 붕규산 바늘 베벨링

1. 기기에서 Heat: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, Loop time 12.24 설정으로 붕규산 유리 마이크로 모세관을 사용하여 미세주사 바늘을 당깁니다.
2. 연마판과 자석이 있는 고정 링¹²로 구성된 제조업체의 지침에 따라 연삭 어셈블리를 조립합니다.
   알림: 연마판은 연마판에서 Photo-Flo(습윤제)가 조기에 누출되는 것을 방지하기 위해 얇은 투명 필름 스트립으로 감싸야 할 수 있습니다. 이것은 습윤제 용액이 받침대 오일로 조기에 누출되어 분쇄판이 회전을 멈추는 경우에만 필요합니다. 습윤제는 베벨 처리 후 유리 바늘에 건조 자국이 생길 위험을 줄여줍니다. 습윤제의 사용은 베벨링 공정에 중요하지 않으며 물을 대체할 수 있습니다.
3. 받침대의 광학적으로 평평한 표면에 받침대 오일 10방울을 떨어뜨리고 연삭 어셈블리를 그 위에 놓습니다. 연삭 조립을 시작합니다.
4. 광원을 켜서 표면을 비춥니다. 광원이 베벨 뒤에 있고 연마판과 바늘에 대해 45° 각도로 빛나는지 확인합니다. 바늘의 그림자가 쉽게 보이도록 조명 각도가 필요합니다. 90x 배율에서 현미경 헤드를 제자리에서 회전합니다. 연마판 회전을 잠시 멈추고 연마판 표면에 현미경을 집중시킵니다.
5. 심지가 완전히 젖을 때까지 심지에 1% 습윤제를 추가합니다. 연마판 표면에 1% 습윤제를 추가합니다. 습윤제가 연마 표면을 덮고 있지만 검은색 고정 링으로 누출되지 않는지 확인하십시오.
6. 미리 젖은 심지를 회전할 때 연마판 표면에 놓습니다. 심지가 연마판의 왼쪽에 있고(위에서 아래를 볼 때) 11시 방향에서 6시 방향(플레이트를 시계 면으로 사용)으로 뻗어 있는지 확인합니다. 심지가 고정 링의 검은색 부분에 끼지 않도록 하십시오.
7. 바늘 홀더에 바늘을 삽입하고(그림 2, d) 고정 링을 조여 바늘을 제자리에 고정합니다. 레귤레이터(그림 1, R)를 열고 압력을 24psi로 높입니다.
8. 코스 조정 손잡이를 돌려 바늘 홀더를 올립니다(그림 2, a) 바늘이 회전하는 연마판의 표면보다 높을 만큼 충분히 높게 올라갔는지 확인한 다음 바늘이 회전하는 연마판 위의 제자리에 회전하도록 전체 조작기를 회전합니다. 비스듬히 깎을 바늘은 판의 회전이 바늘 끝에서 멀어지도록 방향이 지정된 회전 연마판에 놓아야 합니다(그림 3A)
9. 측면에서 보면서 거친 조정 손잡이(그림 2, a)를 사용하여 바늘을 연마판 표면 쪽으로 내립니다. 바늘이 액체 표면에 거의 닿을 때 멈추십시오.
10. 줌을 사용하여 현미경의 배율을 낮춘 다음 바늘이 시야의 중앙에 오도록 현미경을 움직입니다. 중앙에 놓이면 배율을 높여 바늘 끝이 시야 중앙에 유지되도록 매니퓰레이터의 위치를 조정합니다. 최대 배율에 도달하면 연삭 플레이트를 중지하고 연마판 표면에 현미경을 초점을 맞춘 다음 표면에 초점이 맞춰지면 즉시 플레이트의 회전을 다시 시작합니다. 이 시점에서 바늘이 보이지 않을 수 있습니다.
11. 매니퓰레이터 거친 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 연마판 쪽으로 내립니다. 시야에서 바늘의 이미지와 바늘의 그림자가 보입니다. 바늘과 바늘의 그림자가 거의 닿으면 매니퓰레이터 미세 조정 손잡이로 전환하고 바늘과 바늘의 그림자가 닿는 것처럼 보일 때까지 바늘을 계속 내립니다. 이 시점에서 캘리퍼(그림 2, c)를 읽고 판독값을 기록해 두십시오. 연마판의 표면은 이 캘리퍼 판독값 이하입니다.
    알림: 바늘이 회전하는 연마판의 표면에 닿을 때 보기 어렵기 때문에 이 시점에서 바늘이 실제로 연마판에 닿지 않을 수 있습니다.
12. 바늘이 5-10초 동안 이 캘리퍼 판독 수준을 유지하도록 합니다.
13. 매니퓰레이터 미세 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 들어 올려 습윤제 표면 아래에 있는지 확인합니다. 연마판의 회전을 몇 초 동안 멈추고 바늘 끝에서 기포가 빠져나가는지 관찰합니다. 기포가 있는 경우 2.15단계로 진행합니다. 거품이 없으면 2.14단계로 진행합니다.
14. 매니퓰레이터 미세 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 캘리퍼 판독값으로 다시 이동한 다음 약간 아래로 이동하여 새 캘리퍼 판독값을 얻은 다음 2.12-2.13단계를 반복합니다.
15. 연마판을 다시 시작하여 판이 회전하는 동안 기포 형성이 관찰되는지 확인하십시오. 플레이트 회전 중에 기포 형성의 증거가 보이면 바늘 끝의 개구부가 모기 배아 주사와 같은 민감한 배아 미세 주입에 너무 클 수 있습니다. 연마판 회전 중에 기포 형성이 보이지 않는 경우 바늘 개구부는 날카롭고 작은 개구부 바늘이 필요한 절차에 사용하기에 이상적입니다.
16. 매니퓰레이터 코스 조정 손잡이를 사용하여 바늘을 연마판과 현미경에서 멀리 이동시키기 위해 전체 매니퓰레이터를 회전할 때 바늘이 아무 것도 치지 않을 만큼 충분히 높은 플레이트 위의 위치로 바늘을 올립니다.
17. 바늘이 아무 것도 치지 않고 제거할 수 있는 위치에 있으면 기압을 0으로 낮추고 바늘을 제거한 다음 바늘 보관 상자(양면 테이프 또는 비스듬한 바늘을 고정하기 위해 모델링 점토가 있는 페트리 접시)에 사용할 때까지 넣습니다.

3. 비스듬한 바늘의 상대적 개구부 크기 결정

알림: 비스듬한 바늘의 상대적인 개구부 크기를 결정하는 것은 2.13단계에서 수행됩니다. 아래 단계에서는 이 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

1. 연마판이 회전하지 않는 상태에서 2.13단계에서 기포가 관찰되면 바늘 끝에서 기포가 흐르지 않을 때까지 조절기 조정 손잡이(그림 1, R)를 돌려 기압을 천천히 줄입니다. 팁에서 기포가 흐르지 않는 압력에 유의하십시오.
2. 바늘 끝에서 기포가 다시 흐를 때까지 기압을 높입니다. 압력이 높을수록 바늘의 입구가 작아집니다.
3. 2.16-2.17 단계에서 바늘을 안전하게 제거할 수 있는 위치로 이동하십시오.

결과

위에서 설명한 절차는 일관되게 날카로운 미세 주입 바늘을 생성합니다. 날카로운 바늘은 모기 배아와 같은 부드러운 융모막 곤충 배아에 배아 막의 저항이 거의 또는 전혀 없이 삽입할 수 있는 것이 특징입니다. 유전자 변형을 위해 모기 배아를 미세 주입하면 배아막은 상대적으로 탄력이 있습니다. 무딘 바늘을 배아막에 밀어 넣으면 움푹 들어간 곳이 생깁니다(

토론

모기의 유전자 변형은 변형 물질(플라스미드, 가이드 RNA 또는 단백질)을 배배엽 이전 배아 3,4,5,6,7,8에 정밀하게 미세주입하는 데 의존합니다. 이 과정에 중요한 것은 주입 중에 배아를 쉽게 관통하는 날카로운 바늘입니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050