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要約

この研究は、バイオインフォマティクス分析を通じて、多発性硬化症(MS)の病因における低酸素症、フェロトーシス、および免疫浸潤の間の相互作用に関する新しい洞察を提供します。WGCNA(Weighted Gene Coexpression Network Analysis)とPPI(Protein-Interaction Analysis)を用いて、ITGB1、 ITGB8、 VIMの3つの重要なハブ遺伝子を同定しました。

要約

多発性硬化症(MS)は、脱髄を特徴とする慢性炎症性疾患であり、再髄鞘形成の失敗は慢性期の進行性軸索喪失につながります。オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)は、再髄鞘形成に重要です。最近の研究では、低酸素症とフェロトーシスの両方がOPCの機能不全の分化に重要な役割を果たしていることが示唆されています。本研究では、MS患者の人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するOPCの低酸素症やフェロトーシス、免疫浸潤特性に関連する主要な遺伝子を特定し、これらの重要な遺伝子を中心とした診断モデルを構築することを目指しています。

GSE196575データセットとGSE147315データセットから遺伝子発現データを解析し、MS患者と健常者を比較しました。WGCNA(Weighted Gene Coexpression Network Analysis)を用いて、低酸素症、フェロトーシス、MSに関連する一次モジュール遺伝子と必須遺伝子をピンポイントで同定しました。遺伝子セット変動解析(GSVA)により算出されたフェロトーシスZスコアと低酸素Zスコアは、MS患者のiPS細胞由来OPCの方が対照群よりも高かった。Gene Ontology(GO)およびKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)のパスウェイエンリッチメント解析を通じて特定されたように、関与する遺伝子は主にPI3K/Akt/mTOR経路に関連しています。

重要な遺伝子のタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークにより、10個の中央ハブ遺伝子(COL4A1、COL4A2、ITGB5、ITGB1、ITGB8、ITGAV、VIM、FLNA、VCL、 およびSPARC)が明らかになりました。ITGB1、ITGB8、VIMの頑健な発現がGSE151306データセットで検証され、主要なハブ遺伝子としての役割が裏付けられました。さらに、転写因子(TF)とハブ遺伝子との間の相互作用ネットワークは、Transcriptional Regulatory Relationships Unraveled by Sentence-based Text(TRRUST)によって確立され、5つの主要なTFが特定されました。この研究の結果は、MSの新規バイオマーカーまたは治療標的の解明に役立つ可能性があります。

概要

多発性硬化症(MS)は、脱髄を特徴とする慢性炎症性疾患で、世界中で約250万人が罹患しています。MSと診断された人の大多数は、再発寛解型(RR)疾患の経過を示します。再発期には、急性炎症によりミエリンと軸索が必然的に失われます。逆に、寛解期には、脱髄病変は再髄鞘形成によって修復され、軸索に栄養的サポートを提供し、進行性の軸索喪失を防ぐことができます1。再髄鞘形成不全は、MSの慢性期に発生し、進行性の軸索変性2につながります。

再髄鞘形成の過程は、オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)と有意に相関しており、OPCの増殖と遊走が中枢神経系(CNS)のミエリン形成細胞である成熟オリゴデンドロサイト(OL)に分化します3。疾患の初期段階では、脱髄病変の周囲にOPCによって生成された新しいOLの数は比較的保存されており、再髄鞘形成をうまく促進できます4。しかし、進行したMSの段階では、OPCの不適切な移動と分化が新しいOLの減少と再髄鞘形成の障害5につながり、神経変性や障害の蓄積につながります。

多発性硬化症の神経変性を説明するために、2つの仮説が提案されています。この外因性仮説は、活性化されたT細胞によって開始される免疫応答が、神経変性だけでなく脱髄も引き起こすことを示唆しています6。しかし、内因性モデルは、OPCs7、OLs 8、およびCNSの他の細胞における内因性異常が神経変性に寄与している可能性があることを示唆しています。内因性モデルは、以前は、一次または二次進行性MS(PPMSおよびSPMS)などのMSのより進行した段階でのみ適用できると考えられていました。それにもかかわらず、最近、RRMS 9,10では炎症や再発とは無関係の神経変性が観察されており、RRMSを含むすべての疾患ステージに内因性細胞異常が関与している可能性が示唆されています。

さらに、鉄介在性脂質代謝障害に関連する特徴的な細胞死経路であるフェロトーシスは、神経変性において極めて重要な役割を果たしています。この経路は、過剰な鉄によって引き起こされる細胞内酸化還元状態の不均衡を伴い、過酸化脂質の蓄積と活性酸素種(ROS)の生成を引き起こし、最終的に酸化的細胞死をもたらします11。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患は、ニューロン細胞の酸化的損傷に起因し、これは病変内の鉄濃度が異常に高いことによって引き起こされることがよくあります。MSでは、酸化的損傷に対する脆弱性の増加と、CNS細胞の高脂質含有量および酸素消費によるミトコンドリア機能障害が相まって、フェロトーシスの重要な因子である脂質過酸化が促進されます。OLは、フェロトーシス12の本質的な特徴である脂質過酸化に敏感です。脊髄炎症性病変13 の近くの鉄沈着と、脂質過酸化14 およびフリーラジカル15 に対するOLの脆弱性は、MSのフェロトーシスに対する感受性を強調しています。

低酸素症は、多発性硬化症の病因におけるもう一つの重要な要因であり、オリゴデンドロサイトの喪失に寄与します。急性MS病変における低酸素様損傷およびROSおよび窒素酸化物(NO)の生成の証拠は、そのようなストレッサーがミトコンドリア機能障害およびその後のエネルギー不足を引き起こす可能性があることを示している16。この代謝ストレスはOLに影響を与えるだけでなく、ミエリンチャネルがミエリン鞘と軸索周囲空間の間でエネルギーを伝達するため、エネルギー伝達の乱れを通じて隣接する軸索をも損ないます17。

CNSの初代ヒトOPCおよびOLは、MS患者においてアクセスが非常に困難です。したがって、人工多能性幹細胞(iPSC)由来のヒトOPCおよびOLは、MSの内因性疾患を研究するための有望なツールとして浮上しています。MSの病因におけるフェロトーシスと低酸素症の重要な役割とそれらがオリゴデンドロサイトの系統に与える影響に照らして、この研究では、重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)を使用してモジュール情報を抽出し18 、MSのこれらの現象に関連する遺伝子発現パターンを解明しました。遺伝子間の相関係数をスクリーニングすることで、同一または類似の共発現ネットワークまたはモジュールを同定し、MSの新規バイオマーカーまたは潜在的な治療標的に光を当てることができます。さらに、この研究は、重要な遺伝子を調節する転写因子(TF)に焦点を当てることにより、MSのメカニズムと潜在的な介入戦略をさらに調査するための基盤を提供します。

プロトコル

1. データのダウンロードと前処理

  1. Gene Expression Omnibus(GEO)からデータセットGSE196575およびGSE147315をダウンロードします。
  2. 2つのデータセットをマージし、オンライン分析プラットフォームを使用してバッチ効果を削除します( 材料の表を参照)。
    1. [式モジュール] | [データ マージ モジュール] を選択します。2 つの式マトリックス ファイルを入力ファイルとしてアップロードし、[実行] をクリックして、マージされたマトリックスを自動的に出力します。
    2. サンプルの注釈ファイルをスプレッドシートとして作成します。
    3. 式モジュールの選択 |バッチエフェクトモジュールを削除します。注釈ファイルとマージされたマトリックスを入力し、[実行]をクリックして、バッチ効果が削除されたマージされたマトリックス(マージされたマトリックス2)を作成します。
  3. オンライン分析プラットフォームで使用できる マージデータセット、 バッチエフェクト、 および正規化 機能を使用して、式データを正規化します。 式モジュール と 正規化モジュールを選択します。ステップ1.2.3で作成した 入力マージ行列2 。 「実行 」ボタンをクリックします。( 資料の表を参照)。
  4. 上記のプロセス全体を実行した後、式行列ファイルを出力します。GEO Web サイトで提供されている手順に従って、グループ化情報を抽出します。上記の情報を「.txt」形式のドキュメントに入力して、マージされたデータセットのグループ化情報ファイルを作成します。

2. 差次的発現遺伝子解析

  1. Rのlimmaパッケージを用いて遺伝子発現差出量解析を行い、発現マトリックスファイルとグルーピング情報ファイルを入力します。 フィルタリング基準 を |logFC| = 1 および p < 0.05 に設定して、多発性硬化症に関連する差次的に発現する遺伝子 (DEG) を特定します。

3. 機能強化解析(GOおよびKEGG)

  1. オンラインプラットフォーム上のGOモジュールとKEGGモジュールを介して、DEGの機能的濃縮分析を実施します。
    1. モデル生物を ホモ・サピエンスに設定し、Ensemble_109バージョンを背景遺伝子ファイル、遺伝子をデータタイプとして設定しました。
    2. 広範なGO用語は避けてください。ToppFun を使用して解析を絞り込みます。フィルターを適用して、用語を 500 個から 1,000 個の関連遺伝子に制限します。
      注:500遺伝子フィルターの結果は、メイン原稿に記載されています。GOの全結果は 、補足図S2でご覧いただけます。オンラインKEGGプラットフォームは 、補足図S3に示されています。

4. フェロトーシスおよび低酸素症(GSVA)の遺伝子セット変異解析

  1. FerrDbから合計538個のフェロトーシス関連遺伝子を、MsigDBから200個の低酸素関連遺伝子を取り出します。
  2. 両方の遺伝子セットのGMT形式のファイルを作成します。
  3. GSVA モジュールを使用して、マージされたデータセットの各サンプルのフェロトーシス Z スコアと低酸素 Z スコアを計算し、式マトリックス ファイル、グループ化情報ファイル、および GMT ファイルを入力として使用します。
  4. 異なるグループのZスコアを比較します(補足図S4)。

5. 重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)

  1. ステップ4.4で計算した各サンプルのフェロトーシスと低酸素症のZスコアを抽出します。上記のフェロトーシスと低酸素症のZスコアを発現マトリックスファイルと一緒に形質ファイルとして使用し、フェロトーシスと低酸素症に関連する主要な遺伝子モジュールを特定します。
  2. WGCNAモジュールを使用し、R2 = 0.9、ソフトスレッショルドβ = 18に設定して、重み付けされた遺伝子共発現ネットワークを構築します。フェロトーシスと低酸素症の両方に有意に関連するモジュールに焦点を当てます(補足図S4)。

6. MS患者におけるフェロトーシスおよび低酸素症に関連する差次的に発現する遺伝子の同定

  1. オンライン解析プラットフォーム上のベン図ツールを介して、疾患関連のDEGをフェロトーシスおよび低酸素関連遺伝子モジュールと交差させます(補足図S3)。MSのフェロトーシスと低酸素症の両方に関連する遺伝子を特定します。

7. タンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析

  1. 交差した遺伝子をSTRINGデータベースの Multiple Proteins モジュールに入力します。
  2. 生物を「Homo sapiens」に設定し、「検索」をクリックします。
  3. Webページの中央にある [続行 ]オプションを使用して、PPIネットワークを生成します。
  4. インタラクションネットワーク情報をTSV形式でエクスポートし、バイオインフォマティクスネットワーク解析ソフトウェアにインポートします(補足図S5)。
  5. Cytohubbaプラグインを使用して、MCCアルゴリズムに基づいて上位10のハブ遺伝子を同定します。

8. GSE151306データセットによる検証

  1. GEO から GSE151306 データセットをダウンロードします。
  2. R studioソフトウェアのlimmaパッケージ(R言語コードはGitHub:https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS で提供されています)を使用して、異なるグループ間でのハブ遺伝子の発現を検証し、 発現マトリックスファイル、 検証セットのグループ化ファイル、 およびハブ遺伝子リストを入力します。

9. ハブ遺伝子のROC曲線プロット

  1. RのpROCパッケージを使用して、差次的に発現するハブ遺伝子のROC曲線をプロットします。
  2. 検証データセットでこれらのハブ遺伝子の診断値を検証します (R 言語コードは GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS で提供されています)。

10. 転写因子-ハブ遺伝子制御ネットワークの予測

  1. https://www.grnpedia.org/trrust/ でTRRUST v2データベースにアクセスします。
  2. 「Find key regulators for query genes」モジュールを使用して、10 個のハブ遺伝子を調節する転写因子を同定します。
    1. 種族に「人間」を設定します。転写因子とハブ遺伝子をSTRINGのMultiple Proteinsモジュールに入力し、Homo sapiensを生物に設定し、CONTINUEをクリックして制御ネットワークを生成します。

結果

対照として4人の健康な個人と9人のMS患者(PwMS)で構成されるマージされたデータセットは、分析され、4人のPwMSと4人の健康な対照の別のデータセットで検証されました。分析プロトコルを図1に示し、すべてのサンプルの詳細情報を補足表S1に示します。この解析により、706の差次的に発現する遺伝子(DEG、p < 0.01)が同定さ...

ディスカッション

再髄鞘形成プロセスにおけるその極めて重要な役割を考えると、OPCの移動、分化、および死は、MSの病因およびMSの治療標的における重要な要因であると長い間決定されてきました。炎症非依存性の進行性神経変性は、MSの3つのタイプすべてで観察されています19、および脱髄病変の中心でオリゴデンドロサイトの顕著な喪失が認められました

開示事項

著者は、この記事の内容に関連すると宣言する競合する利益を持っていません。

謝辞

この研究は、National High Level Hospital Clinical Research Funding(2022-PUMCH-B-103)の支援と資金提供を受けました。著者は、この記事の改訂段階で貴重なアドバイスと指導をくださったハーバード大学ハーバード大学公衆衛生大学院生物統計学部のShuang Song博士に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
BioInfoTools/online analysis website http://biowinford.site:3838/patrick_wang87/
Cytoscape/bioinformatics network analysis software
GSE196575,GSE147315 and GSE151306/RNA-seq from GEO dataset
OmicshareGENE DENOVOonline analysis tools https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft
R-studioRStudio, IncR integrated development environment software

参考文献

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