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Resumo

Este estudo fornece novos insights sobre as interações entre hipóxia, ferroptose e infiltração imunológica na patogênese da esclerose múltipla (EM) por meio da análise de bioinformática. Ao empregar a análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA) e a análise de interação proteína-proteína (PPI), identificamos três genes centrais (ITGB1, ITGB8 e VIM).

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica caracterizada pela desmielinização, com falha na remielinização levando à perda progressiva do axônio em estágios crônicos. As células precursoras de oligodendrócitos (OPCs) são críticas para a remielinização. Estudos recentes sugerem que tanto a hipóxia quanto a ferroptose desempenham papéis cruciais na diferenciação disfuncional das OPCs. Esta pesquisa busca identificar genes-chave ligados à hipóxia e ferroptose e características de infiltração imune em OPCs derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de pacientes com EM e construir um modelo de diagnóstico centrado nesses genes essenciais.

Analisamos dados de expressão gênica dos conjuntos de dados GSE196575 e GSE147315 e comparamos pacientes com EM com indivíduos saudáveis. Usando análise de rede de coexpressão gênica ponderada (WGCNA), identificamos genes de módulo primário e genes essenciais associados à hipóxia, ferroptose e EM. O escore Z de ferroptose e o escore Z de hipóxia calculados por meio da análise de variação do conjunto de genes (GSVA) foram maiores nos OPCs derivados de iPSC de pacientes com EM do que nos do grupo controle. Os genes implicados estão predominantemente ligados à via PI3K/Akt/mTOR, conforme identificado por meio de análises de enriquecimento da via Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Uma rede de interação proteína-proteína (PPI) de genes cruciais revelou 10 genes centrais (COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL e SPARC). A expressão robusta de ITGB1, ITGB8 e VIM foi validada no conjunto de dados GSE151306, apoiando seu papel como genes-chave do hub. Além disso, uma rede de interação entre fatores de transcrição (TFs) e genes centrais foi estabelecida por meio de Relações Regulatórias Transcricionais Desvendadas por Texto Baseado em Sentenças (TRRUST), que identificou cinco TFs principais. Os resultados deste estudo podem ajudar a elucidar novos biomarcadores ou alvos terapêuticos para EM.

Introdução

A esclerose múltipla (EM) é uma condição inflamatória crônica caracterizada pela desmielinização, que afeta aproximadamente 2,5 milhões de indivíduos em todo o mundo. A maioria das pessoas diagnosticadas com EM apresenta um curso de doença remitente-recorrente (RR). Durante a fase recidivante, a inflamação aguda leva à perda inevitável de mielina e axônios. Por outro lado, durante a remissão, as lesões de desmielinização podem ser reparadas por remielinização, fornecendo suporte trófico aos axônios e evitando a perda progressiva do axônio1. A falha da remielinização ocorre nos estágios crônicos da EM e leva à degeneração axonal progressiva2.

O processo de remielinização está criticamente correlacionado com células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), envolvendo a proliferação e migração de OPCs para se diferenciar em oligodendrócitos maduros (OLs), que são as células formadoras de mielina no sistema nervoso central (SNC)3. Nos estágios iniciais da doença, o número de novos OLs gerados por OPCs ao redor das lesões desmielinizadas é relativamente preservado e pode promover com sucesso a remielinização4. No entanto, durante os estágios avançados da EM, a migração inadequada e a diferenciação de OPCs levam a uma redução de novos OLs e remielinização prejudicada5, levando à degeneração nervosa e ao acúmulo de incapacidade.

Duas hipóteses foram propostas para explicar a neurodegeneração na EM. A hipótese extrínseca sugere que a resposta imune iniciada por células T ativadas causa desmielinização e neurodegeneração6. O modelo intrínseco, no entanto, sugere que as anormalidades intrínsecas nas OPCs7, OLs8 e outras células do SNC podem contribuir para a neurodegeneração. O modelo intrínseco foi anteriormente considerado aplicável apenas em estágios mais avançados da EM, como a EM progressiva primária ou secundária (PPMS e SPMS). No entanto, neurodegeneração independente de inflamação ou recidiva foi recentemente observada na EMRR 9,10, sugerindo que anormalidades celulares intrínsecas podem estar envolvidas em todos os estágios da doença, incluindo EMRR.

Além disso, a ferroptose, uma via distinta de morte celular ligada a distúrbios metabólicos lipídicos mediados por ferro, desempenha um papel fundamental na neurodegeneração. Essa via envolve um desequilíbrio dos estados redox intracelulares impulsionados pelo excesso de ferro, levando ao acúmulo de peróxido lipídico e à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), resultando em morte celular oxidativa11. Doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington, geralmente se originam de danos oxidativos às células neuronais, que são frequentemente desencadeados por concentrações anormalmente altas de ferro nas lesões. Na EM, o aumento da vulnerabilidade ao dano oxidativo, combinado com a disfunção mitocondrial devido ao alto teor de lipídios e consumo de oxigênio das células do SNC, promove a peroxidação lipídica, um fator crítico na ferroptose. Os OLs são sensíveis à peroxidação lipídica, uma característica essencial da ferroptose12. A deposição de ferro próximo a lesões inflamatórias espinhais13 e a vulnerabilidade dos OLs à peroxidação lipídica14 e radicais livres15 destacam a suscetibilidade da SM à ferroptose.

A hipóxia é outro fator crítico na patogênese da EM, contribuindo para a perda de oligodendrócitos. Evidências de danos semelhantes a hipóxia e a geração de ROS e óxido de nitrogênio (NO) em lesões agudas de EM indicam que tais estressores podem precipitar disfunção mitocondrial e déficits energéticos subsequentes16. Esse estresse metabólico não afeta apenas os OLs, mas também prejudica os axônios vizinhos por meio da transferência de energia interrompida17, pois os canais mielínicos transmitem energia entre a bainha de mielina e os espaços periaxonais.

OPCs humanos primários e OLs do SNC são extremamente difíceis de acessar em pacientes com EM. Assim, OPCs e OLs humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) surgiram como ferramentas promissoras para estudar os distúrbios intrínsecos da EM. À luz dos papéis cruciais da ferroptose e hipóxia na patogênese da EM e seu impacto na linhagem de oligodendrócitos, este estudo empregou análise ponderada da rede de coexpressão gênica (WGCNA) para extrair informações do módulo18 e elucidar os padrões de expressão gênica associados a esses fenômenos na EM. Ao rastrear os coeficientes de correlação entre os genes, somos capazes de identificar as mesmas redes ou módulos de coexpressão ou semelhantes, lançando luz sobre novos biomarcadores ou potenciais alvos terapêuticos para EM. Além disso, ao focar nos fatores de transcrição (TFs) que regulam genes críticos, este estudo fornece uma base para uma exploração mais aprofundada dos mecanismos e possíveis estratégias de intervenção para a EM.

Protocolo

1. Download e pré-processamento de dados

  1. Baixe os conjuntos de dados GSE196575 e GSE147315 do Gene Expression Omnibus (GEO).
  2. Mescle os dois conjuntos de dados e remova os efeitos de lote, usando uma plataforma de análise on-line (consulte Tabela de materiais).
    1. Escolha o módulo Expressão | módulo de mesclagem de dados. Carregue os dois arquivos de matriz de expressão como arquivos de entrada e clique em Executar para gerar automaticamente a matriz mesclada.
    2. Crie um arquivo de anotação de amostra como uma planilha.
    3. Escolha o módulo Expressão | Remova o módulo de efeito em lote. Insira o arquivo de anotação e a matriz mesclada e clique em Executar para criar a matriz mesclada com efeito de lote removido (matriz mesclada 2).
  3. Normalize os dados de expressão usando os conjuntos de dados de mesclagem, o efeito de lote e os recursos Normalizar disponíveis em uma plataforma de análise online. Escolha expression module e normalize module. Matriz mesclada de entrada 2 criada na etapa 1.2.3. Clique no botão Executar . (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Saída do arquivo de matriz de expressão depois de executar todo o processo descrito acima. Extraia as informações de agrupamento de acordo com a intervenção fornecida no site do GEO. Insira as informações acima em um documento de formato ".txt" para criar o arquivo de informações de agrupamento para o conjunto de dados mesclado.

2. Análise diferencial de genes expressos

  1. Execute a análise de expressão gênica diferencial usando o pacote limma em R. Insira o arquivo de matriz de expressão e o arquivo de informações de agrupamento. Defina os critérios de filtragem como |logFC| = 1 e p < 0,05 para identificar genes diferencialmente expressos (DEGs) relacionados à esclerose múltipla.

3. Análise de enriquecimento funcional (GO e KEGG)

  1. Realize análises de enriquecimento funcional para os DEGs por meio dos módulos GO e KEGG em plataformas online.
    1. O conjunto do organismo modelo foi definido como Homo sapiens, com a versão Ensemble_109 como o arquivo de gene de fundo e os genes como o tipo de dados.
    2. Evite termos GO amplos; refine a análise usando ToppFun. Aplique filtros para limitar os termos a 500 e 1.000 genes associados.
      NOTA: Os resultados do filtro de 500 genes são apresentados no manuscrito principal. Os resultados completos do GO estão disponíveis na Figura Suplementar S2. A plataforma KEGG online é mostrada na Figura Suplementar S3.

4. Análise de variação do conjunto de genes para ferroptose e hipóxia (GSVA)

  1. Recupere um total de 538 genes relacionados à ferroptose do FerrDb e 200 genes relacionados à hipóxia do MsigDB.
  2. Crie arquivos no formato GMT para ambos os conjuntos de genes.
  3. Use o módulo GSVA para calcular a pontuação Z de ferroptose e a pontuação Z de hipóxia para cada amostra no conjunto de dados mesclado e use o arquivo de matriz de expressão, o arquivo de informações de agrupamento e os arquivos GMT como entradas.
  4. Compare os escores Z de diferentes grupos (Figura Suplementar S4).

5. Análise de Rede de Co-expressão Gênica Ponderada (WGCNA)

  1. Extrair o escore Z de ferroptose e hipóxia de cada amostra, calculado no passo 4.4. Use os escores Z acima de ferroptose e hipóxia como arquivos de características junto com os arquivos da matriz de expressão para identificar os principais módulos genéticos relacionados à ferroptose e hipóxia.
  2. Use o módulo WGCNA e defina R2 = 0,9 e limiar suave β = 18 para construir uma rede de coexpressão gênica ponderada. Concentre-se nos módulos significativamente associados à ferroptose e à hipóxia (Figura Suplementar S4).

6. Identificação de genes diferencialmente expressos relacionados à ferroptose e hipóxia em pacientes com EM

  1. Cruze os DEGs relacionados à doença com módulos genéticos relacionados à ferroptose e hipóxia por meio de uma ferramenta de diagrama de Venn em uma plataforma de análise online (Figura Suplementar S3). Identifique os genes associados à ferroptose e à hipóxia na EM.

7. Análise de rede de interação proteína-proteína (PPI)

  1. Insira os genes cruzados no módulo Proteínas Múltiplas do banco de dados STRING.
  2. Defina o organismo como Homo sapiens e clique em Pesquisar.
  3. Use a opção CONTINUAR no centro da página da Web para gerar a rede PPI.
  4. Exporte as informações da rede de interação no formato TSV e importe-as para o software de análise de rede de bioinformática (Figura Suplementar S5).
  5. Use o plug-in Cytohubba para identificar os 10 principais genes do hub com base no algoritmo MCC.

8. Validação com o conjunto de dados GSE151306

  1. Baixe o conjunto de dados GSE151306 do GEO.
  2. Use o pacote limma no software de estúdio R (os códigos de linguagem R são fornecidos no GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS) para validar a expressão dos genes do hub em diferentes grupos e insira o arquivo de matriz de expressão, o arquivo de agrupamento do conjunto de validação e a lista de genes do hub.

9. Plotagem da curva ROC para genes centrais

  1. Use o pacote pROC em R para traçar curvas ROC para os genes de hub expressos diferencialmente.
  2. Valide o valor de diagnóstico desses genes de hub no conjunto de dados de validação (os códigos de linguagem R são fornecidos no GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS).

10. Predição de redes reguladoras de genes de fator de transcrição

  1. Acesse o banco de dados TRRUST v2 em https://www.grnpedia.org/trrust/.
  2. Use o módulo Localizar reguladores de chave para genes de consulta para identificar fatores de transcrição que regulam os 10 genes centrais.
    1. Definir Humano para a espécie. Insira os fatores de transcrição e os genes centrais no módulo Proteínas Múltiplas do STRING, defina o Homo sapiens para organismos e clique em CONTINUAR para gerar uma rede regulatória.

Resultados

O conjunto de dados mesclado composto por quatro indivíduos saudáveis como controles e nove pessoas com EM (PcMS), foi analisado e validado em outro conjunto de dados de quatro PwMS e quatro controles saudáveis. O protocolo de análise é mostrado na Figura 1, e as informações detalhadas de todas as amostras estão listadas na Tabela Suplementar S1. Por meio da análise, foram identificados 706 genes diferencialmente ex...

Discussão

Dado seu papel central no processo de remielinização, a migração, diferenciação e morte de OPCs há muito são determinadas como fatores cruciais na patogênese da EM e alvos terapêuticos da EM. A degeneração progressiva do nervo independente da inflamação foi observada em todos os três tipos de EM19, e uma perda pronunciada de oligodendrócitos foi observada no centro das lesões desmielinizadas20, sugerindo que distúrbios pri...

Divulgações

Os autores não têm interesses conflitantes a declarar que são relevantes para o conteúdo deste artigo.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado e financiado pelo National High Level Hospital Clinical Research Funding (2022-PUMCH-B-103). Os autores gostariam de agradecer à Dra. Shuang Song, Departamento de Bioestatística, Harvard T. H. Chan School of Public Health, Harvard University, por seus valiosos conselhos e orientações na fase de revisão deste artigo.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BioInfoTools/online analysis website http://biowinford.site:3838/patrick_wang87/
Cytoscape/bioinformatics network analysis software
GSE196575,GSE147315 and GSE151306/RNA-seq from GEO dataset
OmicshareGENE DENOVOonline analysis tools https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft
R-studioRStudio, IncR integrated development environment software

Referências

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