多发性硬化症患者 iPSC 来源的少突胶质细胞前体细胞中铁死亡和缺氧相关基因的鉴定

摘要

本研究通过生物信息学分析为多发性硬化症 （MS） 发病机制中缺氧、铁死亡和免疫浸润之间的相互作用提供了新的见解。通过采用加权基因共表达网络分析 （WGCNA） 和蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 分析，我们确定了三个关键枢纽基因 （ITGB1 、 ITGB8 和 VIM）。

摘要

多发性硬化症 （MS） 是一种慢性炎症性疾病，其特征是脱髓鞘，髓鞘再生失败导致慢性期进行性轴突丢失。少突胶质细胞前体细胞 （OPC） 对髓鞘再生至关重要。最近的研究表明，缺氧和铁死亡在 OPCs 的功能失调分化中起着至关重要的作用。本研究旨在确定 MS 患者诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的 OPC 中与缺氧和铁死亡以及免疫浸润特征相关的关键基因，并构建以这些关键基因为中心的诊断模型。

我们分析了来自 GSE196575 和 GSE147315 数据集的基因表达数据，并将 MS 患者与健康个体进行了比较。使用加权基因共表达网络分析 （WGCNA），我们确定了与缺氧、铁死亡和 MS 相关的初级模块基因和必需基因。MS 患者 iPSC 来源的 OPCs 中的铁死亡 Z 评分和通过基因集变异分析 （GSVA） 计算的缺氧 Z 评分高于对照组。相关基因主要与 PI3K/Akt/mTOR 通路有关，通过基因本体论 （GO） 和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 通路富集分析确定。

关键基因的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络揭示了 10 个中心枢纽基因 （COL4A1 、 COL4A2 、 ITGB5 、 ITGB1 、 ITGB8 、 ITGAV 、 VIM 、 FLNA 、 VCL 和 SPARC ）。ITGB1 、 ITGB8 和 VIM 的稳健表达在 GSE151306 数据集中得到验证，支持它们作为关键枢纽基因的作用。此外，通过基于句子的文本解开的转录调控关系 （TRRUST） 建立了转录因子 （TFs） 和枢纽基因之间的相互作用网络，该网络确定了五个关键 TFs。这项研究的结果可能有助于阐明 MS 的新型生物标志物或治疗靶点。

引言

多发性硬化症 （MS） 是一种以脱髓鞘为特征的慢性炎症性疾病，影响全球约 250 万人。大多数被诊断患有 MS 的患者表现出复发缓解 （RR） 病程。在复发期，急性炎症导致髓鞘和轴突不可避免地丢失。相反，在缓解期，脱髓鞘病变可以通过髓鞘再生来修复，为轴突提供营养支持并防止进行性轴突丢失¹。髓鞘再生衰竭发生在 MS 的慢性阶段，并导致进行性轴突变性²。

髓鞘再生过程与少突胶质细胞前体细胞 （OPC） 密切相关，涉及 OPC 的增殖和迁移以分化为成熟的少突胶质细胞 （OL），它们是中枢神经系统 （CNS） 中的髓鞘形成细胞³。在疾病初期，OPCs 在脱髓鞘病灶周围产生的新 OLs 数量相对保留，并且可以成功促进髓鞘再生⁴。然而，在晚期 MS 阶段，OPC 的迁移和分化不足导致新 OL 减少和髓鞘再生受损⁵，从而导致神经退化和残疾积累。

已经提出了两种假设来解释 MS 中的神经退行性变。外源性假说表明，活化的 T 细胞引发的免疫反应会导致脱髓鞘和神经退行性变⁶。然而，内在模型表明，OPCs⁷、OLs⁸ 和 CNS 中其他细胞的内在异常可能导致神经退行性变。本征模型以前被认为仅适用于更晚期的 MS，例如原发性或继发性进行性 MS（PPMS 和 SPMS）。然而，最近在 RRMS 中观察到独立于炎症或复发的神经退行性变 ^9,10，这表明包括 RRMS 在内的所有疾病阶段都可能涉及内在细胞异常。

此外，铁死亡是一种与铁介导的脂质代谢紊乱有关的独特细胞死亡途径，在神经退行性变中起着关键作用。该通路涉及由过量铁驱动的细胞内氧化还原态的不平衡，导致脂质过氧化物积累和活性氧 （ROS） 产生，最终导致氧化细胞死亡¹¹。神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病，通常起源于神经元细胞的氧化损伤，这通常是由病变内异常高的铁浓度引发的。在 MS 中，对氧化损伤的易感性增加，加上由于 CNS 细胞的高脂质含量和耗氧量而导致的线粒体功能障碍，促进了脂质过氧化，这是铁死亡的一个关键因素。OL 对脂质过氧化敏感，这是铁死亡¹² 的基本特征。脊髓炎性病变¹³ 附近的铁沉积以及 OL 对脂质过氧化¹⁴ 和自由基¹⁵ 的脆弱性突出了 MS 对铁死亡的易感性。

缺氧是导致少突胶质细胞丢失的 MS 发病机制中的另一个关键因素。急性 MS 病变中缺氧样损伤以及 ROS 和氮氧化物 （NO） 的产生表明，此类应激源可能会诱发线粒体功能障碍和随后的能量损失¹⁶。这种代谢应激不仅影响 OL，还会通过破坏能量传递来损害邻近的轴突¹⁷，因为髓鞘通道在髓鞘和轴突周围间隙之间传递能量。

MS 患者极难获得 CNS 的原代人类 OPC 和 OL。因此，诱导多能干细胞 （iPSC） 衍生的人 OPC 和 OL 已成为研究 MS 内在疾病的有前途的工具。鉴于铁死亡和缺氧在 MS 发病机制中的关键作用及其对少突胶质细胞谱系的影响，本研究采用加权基因共表达网络分析 （WGCNA） 提取模块信息¹⁸ 并阐明与 MS 中这些现象相关的基因表达模式。通过筛选基因之间的相关系数，我们能够识别相同或相似的共表达网络或模块，从而揭示 MS 的新型生物标志物或潜在的治疗靶点。此外，通过关注调控关键基因的转录因子 （TFs），本研究为进一步探索 MS 的机制和潜在的干预策略提供了基础。

研究方案

1. 数据下载和预处理

1. 从 Gene Expression Omnibus （GEO） 下载数据集GSE196575和GSE147315。
2. 使用在线分析平台合并两个数据集并删除批处理效果（请参阅 材料表）。
   1. 选择 Expression module |data merge 模块。将两个表达式矩阵文件作为输入文件上传，然后单击 Run 自动输出合并后的矩阵。
   2. 将示例注释文件创建为电子表格。
   3. 选择 Expression 模块 |移除批量效果模块。输入注释文件和合并矩阵，然后单击 Run 以创建删除批处理效果的合并矩阵（合并矩阵 2）。
3. 使用在线分析平台上提供的 合并数据集、 批处理效果和 标准化 功能对表达式数据进行标准化。选择 expression module （表达式模块 ） 和 normalize module （规范化模块）。在步骤 1.2.3 中创建的输入 合并矩阵 2 。单击 Run 按钮。（见 材料表）。
4. 运行上述整个过程后，输出表达式矩阵文件。根据 GEO 网站上提供的干预提取分组信息。在 “.txt” 格式文档中输入上述信息，以创建合并数据集的分组信息文件。

2. 差异表达基因分析

1. 使用 R 中的 limma 包进行差异基因表达分析。输入表达矩阵文件和分组信息文件。将 过滤标准 设置为 |logFC| = 1 和 p < 0.05 ，以识别与多发性硬化症相关的差异表达基因 （DEG）。

3. 功能富集分析（GO 和 KEGG）

1. 通过在线平台上的 GO 和 KEGG 模块对 DEG 进行功能富集分析。
   1. 将模式生物设置为 Homo sapiens，Ensemble_109版本作为背景基因文件，基因作为数据类型。
   2. 避免宽泛的 GO 术语;使用 ToppFun 优化分析。应用筛选器以将术语限制为 500 和 1,000 个关联基因。
      注：500 个基因过滤器的结果显示在主要手稿中。完整的 GO 结果可在 补充图 S2 中找到。在线 KEGG 平台如 补充图 S3 所示。

4. 铁死亡和缺氧 （GSVA） 的基因集变异分析

1. 从 FerrDb 中检索总共 538 个铁死亡相关基因，从 MsigDB 中检索到 200 个缺氧相关基因。
2. 为两个基因集创建 GMT 格式文件。
3. 使用 GSVA 模块计算合并数据集中每个样本的铁死亡 Z 评分和缺氧 Z 评分，并使用 表达式矩阵文件、 分组信息文件和 GMT 文件 作为输入。
4. 比较不同组的 Z 分数（补充图 S4）。

5. 加权基因共表达网络分析 （WGCNA）

1. 提取步骤 4.4 中计算的每个样品的铁死亡和缺氧的 Z 评分。使用上述铁死亡和缺氧的 Z 分数作为性状文件以及表达矩阵文件来识别与铁死亡和缺氧相关的关键基因模块。
2. 使用 WGCNA 模块并设置 R² = 0.9 和 软阈值 β = 18 来构建加权基因共表达网络。专注于与铁死亡和缺氧显着相关的模块（补充图 S4）。

6. 鉴定 MS 患者与铁死亡和缺氧相关的差异表达基因

1. 通过在线分析平台上的维恩图工具将疾病相关的 DEGs 与铁死亡和缺氧相关的基因模块相交（补充图 S3）。鉴定与 MS 中铁死亡和缺氧相关的基因。

7. 蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络分析

1. 将交叉基因输入到 STRING 数据库的 Multiple Proteins 模块中。
2. 将 生物 体设置为 Homo sapiens ，然后单击 Search。
3. 使用网页中心的 CONTINUE （继续 ） 选项生成 PPI 网络。
4. 以 TSV 格式导出交互网络信息并将其导入生物信息学网络分析软件（补充图 S5）。
5. 使用 Cytohubba 插件根据 MCC 算法识别前 10 个枢纽基因。

8. 使用 GSE151306 数据集进行验证

1. 从 GEO 下载 GSE151306 数据集。
2. 使用 R studio 软件中的 limma 包（GitHub 中提供 R 语言代码：https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS）验证不同组的 hub 基因表达，并输入 表达矩阵文件、 验证集的分组文件和 hub 基因列表。

9. 枢纽基因的 ROC 曲线图

1. 使用 R 中的 pROC 软件包绘制差异表达枢纽基因的 ROC 曲线。
2. 在验证数据集中验证这些中心基因的诊断值（GitHub 中提供了 R 语言代码：https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS）。

10. 转录因子-枢纽基因调控网络的预测

1. 在 https://www.grnpedia.org/trrust/ 访问 TRRUST v2 数据库。
2. 使用 Find key regulators for query genes 模块来识别调节 10 个枢纽基因的转录因子。
   1. 将 Human 设置为物种。将转录因子和枢纽基因输入到 STRING 的 Multiple Proteins 模块中，为 organisms 设置 Homo sapiens，然后单击 CONTINUE 生成调控网络。

结果

对由 4 名健康个体作为对照和 9 名 MS 患者 （PwMS） 组成的合并数据集进行了分析，然后在另一个由 4 个 PwMS 和 4 个健康对照组成的数据集中进行了验证。分析方案如图 1 所示，所有样品的详细信息列在补充表 S1 中。通过分析，鉴定出 706 个差异表达基因 （DEGs， p < 0.01），与对照组相比，MS 患者其中 378 个基因上调，328 个?...

讨论

鉴于其在髓鞘再生过程中的关键作用，OPC 的迁移、分化和死亡长期以来已被确定为 MS 发病机制和 MS 治疗靶点的关键因素。在所有三种类型的 MS¹⁹ 中都观察到炎症非依赖性进行性神经变性，并且在脱髓鞘病变的中心观察到少突胶质细胞的明显丢失²⁰，表明少突胶质细胞谱系细胞的原发性疾病可以加速 MS 的进展。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioInfoTools	/		online analysis website http://biowinford.site:3838/patrick_wang87/
Cytoscape	/		bioinformatics network analysis software
GSE196575,GSE147315 and GSE151306	/		RNA-seq from GEO dataset
Omicshare	GENE DENOVO		online analysis tools https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft
R-studio	RStudio, Inc		R integrated development environment software