Identification de gènes liés à la ferroptose et à l’hypoxie dans des cellules précurseurs d’oligodendrocytes dérivées d’iPSC de patients atteints de sclérose en plaques

Résumé

Cette étude fournit de nouvelles perspectives sur les interactions entre l’hypoxie, la ferroptose et l’infiltration immunitaire dans la pathogenèse de la sclérose en plaques (SEP) grâce à l’analyse bioinformatique. En utilisant l’analyse de réseau de coexpression génique pondérée (WGCNA) et l’analyse d’interaction protéine-protéine (IPP), nous avons identifié trois gènes pivots (ITGB1, ITGB8 et VIM).

Résumé

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par une démyélinisation, l’échec de la remyélinisation entraînant une perte progressive des axones aux stades chroniques. Les cellules précurseurs des oligodendrocytes (OPC) sont essentielles à la remyélinisation. Des études récentes suggèrent que l’hypoxie et la ferroptose jouent toutes deux un rôle crucial dans la différenciation dysfonctionnelle des OPC. Cette recherche vise à identifier les gènes clés liés à l’hypoxie et à la ferroptose et les caractéristiques d’infiltration immunitaire dans les OPC dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de patients atteints de SEP et à construire un modèle diagnostique centré sur ces gènes pivots.

Nous avons analysé les données d’expression génique des ensembles de données GSE196575 et GSE147315 et comparé des patients atteints de SEP à des individus en bonne santé. À l’aide de l’analyse du réseau de coexpression génique pondérée (WGCNA), nous avons identifié les gènes du module primaire et les gènes essentiels associés à l’hypoxie, à la ferroptose et à la SEP. Le score Z de la ferroptose et le score Z de l’hypoxie calculés par l’analyse de la variation de l’ensemble des gènes (GSVA) étaient plus élevés dans les OPC dérivés de l’iPSC des patients atteints de SEP que dans ceux du groupe témoin. Les gènes impliqués sont principalement liés à la voie PI3K/Akt/mTOR, telle qu’identifiée par les analyses d’enrichissement de la voie Gene Ontology (GO) et Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

Un réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) de gènes cruciaux a révélé 10 gènes centraux (COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL et SPARC). L’expression robuste d’ITGB1, d’ITGB8 et de VIM a été validée dans l’ensemble de données GSE151306, soutenant leur rôle de gènes clés du hub. De plus, un réseau d’interaction entre les facteurs de transcription (TF) et les gènes pivots a été établi via TRRUST (Transcriptional Regulatory Relationships Unraveled by Sentence-based Text), qui a identifié cinq TF clés. Les résultats de cette étude pourraient aider à élucider de nouveaux biomarqueurs ou cibles thérapeutiques pour la SP.

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par une démyélinisation qui touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde. La majorité des personnes diagnostiquées avec la SEP présentent une évolution cyclique de la maladie. Au cours de la phase récurrente, l’inflammation aiguë entraîne la perte inévitable de myéline et d’axones. À l’inverse, pendant la rémission, les lésions de démyélinisation peuvent être réparées par la remyélinisation, fournissant un soutien trophique aux axones et empêchant la perte progressive d’axones¹. L’échec de la remyélinisation survient aux stades chroniques de la SP et entraîne une dégénérescence axonale progressive².

Le processus de remyélinisation est fortement corrélé avec les cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), impliquant la prolifération et la migration des OPC pour se différencier en oligodendrocytes (OL) matures, qui sont les cellules formant la myéline dans le système nerveux central (SNC)³. Dans les premiers stades de la maladie, le nombre de nouveaux OL générés par les OPC autour des lésions démyélinisées est relativement préservé et peut favoriser avec succès la remyélinisation⁴. Cependant, au cours des stades avancés de la SEP, la migration et la différenciation inadéquates des OPC entraînent une réduction des nouvelles OL et une altération de la remyélinisation⁵, entraînant ainsi une dégénérescence nerveuse et une accumulation d’invalidité.

Deux hypothèses ont été proposées pour expliquer la neurodégénérescence dans la SP. L’hypothèse extrinsèque suggère que la réponse immunitaire initiée par les lymphocytes T activés provoque une démyélinisation ainsi qu’une neurodégénérescence6. Le modèle intrinsèque, cependant, suggère que les anomalies intrinsèques dans les OPC⁷, les OL⁸ et d’autres cellules du SNC peuvent contribuer à la neurodégénérescence. Auparavant, on considérait que le modèle intrinsèque ne s’appliquait qu’aux stades plus avancés de la SP, comme la SP progressive primaire ou secondaire (SPPP et SPPS). Néanmoins, une neurodégénérescence indépendante de l’inflammation ou de la rechute a récemment été observée dans la SEP-RR ^9,10, ce qui suggère que des anomalies cellulaires intrinsèques peuvent être impliquées à tous les stades de la maladie, y compris la SEP-RR.

De plus, la ferroptose, une voie de mort cellulaire distinctive liée à des perturbations métaboliques lipidiques médiées par le fer, joue un rôle central dans la neurodégénérescence. Cette voie implique un déséquilibre des états redox intracellulaires induit par un excès de fer, conduisant à l’accumulation de peroxyde lipidique et à la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), entraînant finalement la mort cellulaire oxydative¹¹. Les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington proviennent souvent de dommages oxydatifs aux cellules neuronales, qui sont fréquemment déclenchés par des concentrations de fer inhabituellement élevées dans les lésions. Dans le cas de la SP, la vulnérabilité accrue aux dommages oxydatifs, combinée à un dysfonctionnement mitochondrial dû à la teneur élevée en lipides et à la consommation d’oxygène des cellules du SNC, favorise la peroxydation des lipides, un facteur critique de la ferroptose. Les OL sont sensibles à la peroxydation lipidique, une caractéristique essentielle de la ferroptose¹². Le dépôt de fer près des lésions inflammatoires de la colonne vertébrale¹³ et la vulnérabilité des OL à la peroxydation lipidique¹⁴ et aux radicaux libres¹⁵ mettent en évidence la sensibilité de la SEP à la ferroptose.

L’hypoxie est un autre facteur critique de la pathogenèse de la SP, qui contribue à la perte d’oligodendrocytes. Les signes de lésions semblables à l’hypoxie et la production de ROS et d’oxyde d’azote (NO) dans les lésions aiguës de la SEP indiquent que ces facteurs de stress peuvent précipiter le dysfonctionnement mitochondrial et les déficits énergétiques qui en découlent¹⁶. Ce stress métabolique affecte non seulement les OL, mais altère également les axones voisins par le biais d’un transfert d’énergie perturbé¹⁷, car les canaux myéliniques transmettent l’énergie entre la gaine de myéline et les espaces péri-axonaux.

Les OPC et les OL primaires du SNC sont extrêmement difficiles d’accès chez les patients atteints de SEP. Par conséquent, les OPC et les OL humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) sont apparus comme des outils prometteurs pour étudier les troubles intrinsèques de la SP. À la lumière des rôles cruciaux de la ferroptose et de l’hypoxie dans la pathogenèse de la SP et de leur impact sur la lignée des oligodendrocytes, cette étude a utilisé l’analyse pondérée des réseaux de coexpression génique (WGCNA) pour extraire des informations de module¹⁸ et pour élucider les modèles d’expression génique associés à ces phénomènes dans la SP. En examinant les coefficients de corrélation entre les gènes, nous sommes en mesure d’identifier des réseaux ou des modules de coexpression identiques ou similaires, ce qui met en lumière de nouveaux biomarqueurs ou des cibles thérapeutiques potentielles pour la SP. De plus, en mettant l’accent sur les facteurs de transcription (TF) qui régulent les gènes critiques, cette étude jette les bases d’une exploration plus approfondie des mécanismes et des stratégies d’intervention potentielles dans le domaine de la SP.

Protocole

1. Téléchargement et prétraitement des données

1. Téléchargez les ensembles de données GSE196575 et GSE147315 à partir du Gene Expression Omnibus (GEO).
2. Fusionnez les deux ensembles de données et supprimez les effets de lot, à l’aide d’une plateforme d’analyse en ligne (voir Tableau des matériaux).
   1. Choisissez le module Module d’expression | fusion de données. Téléchargez les deux fichiers de matrice d’expression en tant que fichiers d’entrée et cliquez sur Exécuter pour générer automatiquement la matrice fusionnée.
   2. Créez un exemple de fichier d’annotation sous forme de feuille de calcul.
   3. Choisissez le module Expression | Retirez le module d’effet par lots. Entrez le fichier d’annotation et la matrice fusionnée et cliquez sur Exécuter pour créer la matrice fusionnée avec l’effet de lot supprimé (matrice fusionnée 2).
3. Normalisez les données d’expression à l’aide des fonctionnalités de fusion des jeux de données, d’effet de lot et de normalisation disponibles sur une plate-forme d’analyse en ligne. Choisissez le module d’expression et le module de normalisation. Entrez la matrice fusionnée 2 créée à l’étape 1.2.3. Cliquez sur le bouton Exécuter . (voir la table des matériaux).
4. Générez le fichier de matrice d’expression après avoir exécuté l’ensemble du processus décrit ci-dessus. Extraire les informations de regroupement en fonction de l’intervention fournie sur le site web du GEO. Entrez les informations ci-dessus dans un document au format « .txt » pour créer le fichier d’informations de regroupement pour l’ensemble de données fusionné.

2. Analyse différentielle des gènes exprimés

1. Effectuez une analyse différentielle de l’expression génique à l’aide du package limma dans R. Entrez le fichier de matrice d’expression et le fichier d’informations de regroupement. Définissez les critères de filtrage sur |logFC| = 1 et p < 0,05 pour identifier les gènes exprimés différentiellement (DEG) liés à la sclérose en plaques.

3. Analyse d’enrichissement fonctionnel (GO et KEGG)

1. Effectuer une analyse d’enrichissement fonctionnel pour les DEG via les modules GO et KEGG sur des plateformes en ligne.
   1. L’ensemble de l’organisme modèle a été défini sur Homo sapiens, avec la version Ensemble_109 comme fichier de gènes de base et les gènes comme type de données.
   2. Évitez les termes généraux de GO ; affiner l’analyse à l’aide de ToppFun. Appliquez des filtres pour limiter les termes à 500 et 1 000 gènes associés.
      REMARQUE : Les résultats du filtre de 500 gènes sont présentés dans le manuscrit principal. Les résultats complets de GO sont disponibles dans la figure supplémentaire S2. La plateforme en ligne KEGG est illustrée à la figure supplémentaire S3.

4. Analyse de la variation des ensembles de gènes pour la ferroptose et l’hypoxie (GSVA)

1. Récupérez un total de 538 gènes liés à la ferroptose à partir de FerrDb et 200 gènes liés à l’hypoxie à partir de MsigDB.
2. Créez des fichiers au format GMT pour les deux ensembles de gènes.
3. Utilisez le module GSVA pour calculer le score Z de la ferroptose et le score Z de l’hypoxie pour chaque échantillon de l’ensemble de données fusionné, et utilisez le fichier de matrice d’expression, le fichier d’informations de regroupement et les fichiers GMT comme entrées.
4. Comparez les scores Z de différents groupes (figure supplémentaire S4).

5. Analyse pondérée du réseau de co-expression génique (WGCNA)

1. Extrayez le score Z de ferroptose et d’hypoxie de chaque échantillon calculé à l’étape 4.4. Utilisez les scores Z ci-dessus de la ferroptose et de l’hypoxie comme fichiers de traits à côté des fichiers de matrice d’expression pour identifier les modules de gènes clés liés à la ferroptose et à l’hypoxie.
2. Utilisez le module WGCNA et définissez R² = 0,9 et un seuil doux β = 18 pour construire un réseau pondéré de coexpression génique. Focus sur les modules significativement associés à la ferroptose et à l’hypoxie (Figure supplémentaire S4).

6. Identification des gènes exprimés de manière différentielle liés à la ferroptose et à l’hypoxie chez les patients atteints de SEP

1. Intersection des DEG liés à la maladie avec les modules de gènes liés à la ferroptose et à l’hypoxie à l’aide d’un outil de diagramme de Venn sur une plateforme d’analyse en ligne (figure supplémentaire S3). Identifier les gènes associés à la ferroptose et à l’hypoxie dans la SP.

7. Analyse du réseau d’interaction protéine-protéine (IPP)

1. Entrez les gènes intersectés dans le module Multiple Proteins de la base de données STRING.
2. Définissez l’organisme sur Homo sapiens et cliquez sur Rechercher.
3. Utilisez l’option CONTINUER au centre de la page Web pour générer le réseau PPI.
4. Exporter les informations du réseau d’interaction au format TSV et les importer dans un logiciel d’analyse de réseau bio-informatique (figure supplémentaire S5).
5. Utilisez le plugin Cytohubba pour identifier les 10 principaux gènes pivots sur la base de l’algorithme MCC.

8. Validation avec le jeu de données GSE151306

1. Téléchargez le jeu de données GSE151306 à partir de GEO.
2. Utilisez le package limma dans le logiciel R studio (les codes de langage R sont fournis dans GitHub : https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS) pour valider l’expression des gènes hub dans différents groupes, et entrez le fichier de matrice d’expression, le fichier de regroupement de l’ensemble de validation et la liste des gènes hub.

9. Tracé de la courbe ROC pour les gènes de moyeu

1. Utilisez le package pROC dans R pour tracer des courbes ROC pour les gènes de hub exprimés de manière différentielle.
2. Validez la valeur de diagnostic de ces gènes de hub dans le jeu de données de validation (les codes de langue R sont fournis dans GitHub : https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS).

10. Prédiction des réseaux de régulation des gènes du facteur de transcription

1. Accédez à la base de données TRRUST v2 à l’https://www.grnpedia.org/trrust/.
2. Utilisez le module Trouver des régulateurs clés pour interroger les gènes pour identifier les facteurs de transcription régulant les 10 gènes pivots.
   1. Définissez Humain pour l’espèce. Entrez les facteurs de transcription et les gènes centraux dans le module Multiple Proteins de STRING, définissez Homo sapiens pour les organismes et cliquez sur CONTINUER pour générer un réseau de régulation.

Résultats

L’ensemble de données fusionné, composé de quatre personnes en bonne santé comme témoins et de neuf personnes atteintes de SP (SP-TP), a été analysé, puis validé dans un autre ensemble de données composé de quatre témoins atteints de SP et de quatre témoins sains. Le protocole d’analyse est illustré à la figure 1, et les informations détaillées de tous les échantillons sont énumérées dans le tableau suppléme...

Discussion

Étant donné leur rôle central dans le processus de remyélinisation, la migration, la différenciation et la mort des COP sont considérées depuis longtemps comme des facteurs cruciaux dans la pathogenèse de la SP et ses cibles thérapeutiques. Une dégénérescence nerveuse progressive indépendante de l’inflammation a été observée dans les trois types de SP¹⁹, et une perte prononcée d’oligodendrocytes a été observée au centre des lésions démyé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BioInfoTools	/		online analysis website http://biowinford.site:3838/patrick_wang87/
Cytoscape	/		bioinformatics network analysis software
GSE196575,GSE147315 and GSE151306	/		RNA-seq from GEO dataset
Omicshare	GENE DENOVO		online analysis tools https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft
R-studio	RStudio, Inc		R integrated development environment software