АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это исследование дает новое представление о взаимодействии между гипоксией, ферроптозом и иммунной инфильтрацией в патогенезе рассеянного склероза (РС) с помощью биоинформатического анализа. Используя взвешенный анализ сети коэкспрессии генов (WGCNA) и анализ белок-белковых взаимодействий (PPI), мы идентифицировали три ключевых гена-хаба (ITGB1, ITGB8 и VIM).

Аннотация

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся демиелинизацией, при этом неудачная ремиелинизация приводит к прогрессирующей потере аксонов на хронических стадиях. Клетки-предшественники олигодендроцитов (ОПК) имеют решающее значение для ремиелинизации. Недавние исследования показывают, что как гипоксия, так и ферроптоз играют решающую роль в дисфункциональной дифференцировке OPC. Это исследование направлено на выявление ключевых генов, связанных с гипоксией и ферроптозом, а также характеристиками иммунной инфильтрации в OPC, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) пациентов с рассеянным склерозом, и на построение диагностической модели, основанной на этих ключевых генах.

Мы проанализировали данные экспрессии генов из наборов данных GSE196575 и GSE147315 и сравнили пациентов с рассеянным склерозом со здоровыми людьми. Используя взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов (WGCNA), мы точно определили гены первичного модуля и основные гены, связанные с гипоксией, ферроптозом и рассеянным склерозом. Z-балл ферроптоза и Z-балл гипоксии, рассчитанные с помощью анализа вариаций набора генов (GSVA), были выше в OPC пациентов с РС, полученных из iPSC, чем в контрольной группе. Вовлеченные гены преимущественно связаны с путем PI3K/Akt/mTOR, что было выявлено с помощью анализа обогащения пути Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).

Сеть белок-белковых взаимодействий (PPI) ключевых генов выявила 10 центральных узловых генов (COL4A1, COL4A2, ITGB5, ITGB1, ITGB8, ITGAV, VIM, FLNA, VCL и SPARC). Устойчивая экспрессия ITGB1, ITGB8 и VIM была подтверждена в наборе данных GSE151306, что подтверждает их роль в качестве ключевых генов-хабов. Кроме того, сеть взаимодействия между факторами транскрипции (TFs) и генами-хабами была установлена с помощью технологии Transcriptional Regulatory Relationships, Unraveled by Sentence-based Text (TRRUST), которая идентифицировала пять ключевых TF. Результаты этого исследования могут помочь пролить свет на новые биомаркеры или терапевтические мишени для лечения рассеянного склероза.

Введение

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся демиелинизацией, которое поражает около 2,5 миллионов человек во всем мире. У большинства пациентов с диагнозом РС наблюдается рецидивирующе-ремиттирующее (RR) течение заболевания. Во время фазы рецидива острое воспаление приводит к неизбежной потере миелина и аксонов. И наоборот, во время ремиссии демиелинизированные поражения могут быть восстановлены путем ремиелинизации, обеспечивая трофическую поддержку аксонам и предотвращая прогрессирующую потерю аксонов1. Сбой ремиелинизации возникает на хронических стадиях РС и приводит к прогрессирующей аксональной дегенерации2.

Процесс ремиелинизации критически коррелирует с клетками-предшественниками олигодендроцитов (ОПК), включая пролиферацию и миграцию ОПК для дифференцировки в зрелые олигодендроциты (ОЛ), которые являются миелинобразующими клетками в центральной нервной системе (ЦНС)3. На начальных стадиях заболевания количество новых ОЛ, генерируемых OPC вокруг демиелинизированных поражений, относительно сохраняется и может успешно способствовать ремиелинизации4. Однако на поздних стадиях РС недостаточная миграция и дифференцировка ОПЦ приводят к снижению новых ОЛ и нарушению ремиелинизации5, что приводит к нервной дегенерации и накоплению инвалидности.

Были предложены две гипотезы для объяснения нейродегенерации при рассеянном склерозе. Внешняя гипотеза предполагает, что иммунный ответ, инициируемый активированными Т-клетками, вызывает демиелинизацию, а такженейродегенерацию. Однако внутренняя модель предполагает, что внутренние аномалии в OPCs7, OLs8 и других клетках ЦНС могут способствовать нейродегенерации. Ранее считалось, что внутренняя модель применима только на более поздних стадиях РС, таких как первичный или вторичный прогрессирующий РС (PPMS и SPMS). Тем не менее, нейродегенерация, не зависящая от воспаления или рецидива, недавно наблюдалась при RRMS 9,10, что позволяет предположить, что внутренние клеточные аномалии могут быть вовлечены на всех стадиях заболевания, включая RRMS.

Кроме того, ферроптоз, особый путь гибели клеток, связанный с железо-опосредованными нарушениями метаболизма липидов, играет ключевую роль в нейродегенерации. Этот путь включает в себя дисбаланс внутриклеточных окислительно-восстановительных состояний, вызванный избытком железа, что приводит к накоплению перекиси липидов и производству активных форм кислорода (АФК), что в конечном итоге приводитк окислительной гибели клеток. Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, часто возникают из-за окислительного повреждения нейрональных клеток, которое часто вызывается необычно высокими концентрациями железа в поражениях. При РС повышенная уязвимость к окислительному повреждению в сочетании с митохондриальной дисфункцией из-за высокого содержания липидов и потребления кислорода клетками ЦНС способствует перекисному окислению липидов, что является критическим фактором ферроптоза. ОЛ чувствительны к перекисному окислению липидов, что является существенным признаком ферроптоза12. Отложение железа вблизи воспалительных поражений позвоночника13 и уязвимость ОЛ к перекисному окислению липидов14 и свободным радикалам15 подчеркивают восприимчивость МС к ферроптозу.

Гипоксия является еще одним критическим фактором патогенеза РС, способствующим потере олигодендроцитов. Данные о гипоксииподобном повреждении и образовании АФК и оксида азота (NO) при острых поражениях РС указывают на то, что такие стрессоры могут ускорять митохондриальную дисфункцию и последующий дефицитэнергии. Этот метаболический стресс не только влияет на ОЛ, но и ухудшает работу соседних аксонов из-за нарушения передачиэнергии17, поскольку миелиновые каналы передают энергию между миелиновой оболочкой и периаксональными пространствами.

Первичные человеческие OPC и OLs ЦНС чрезвычайно труднодоступны у пациентов с РС. Таким образом, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из человеческих ОПЦ и ОЛ, стали многообещающими инструментами для изучения внутренних нарушений РС. В свете решающей роли ферроптоза и гипоксии в патогенезе РС и их влияния на линию олигодендроцитов, в данном исследовании был использован взвешенный анализ сети коэкспрессии генов (WGCNA) для извлечения информации о модуле18 и выяснения паттернов экспрессии генов, связанных с этими явлениями при РС. Проводя скрининг коэффициентов корреляции между генами, мы можем идентифицировать одинаковые или похожие сети или модули коэкспрессии, проливая свет на новые биомаркеры или потенциальные терапевтические мишени для РС. Кроме того, сосредоточившись на факторах транскрипции (ТФ), которые регулируют критические гены, это исследование обеспечивает основу для дальнейшего изучения механизмов и потенциальных стратегий вмешательства при РС.

протокол

1. Загрузка и предварительная обработка данных

  1. Загрузите наборы данных GSE196575 и GSE147315 из Омнибуса экспрессии генов (GEO).
  2. Объедините два набора данных и удалите пакетные эффекты с помощью онлайн-платформы анализа (см. Таблицу материалов).
    1. Выберите модуль Выражение | модуль слияния данных. Загрузите два файла матрицы выражений в качестве входных файлов и нажмите кнопку Выполнить, чтобы автоматически вывести объединенную матрицу.
    2. Создайте образец файла аннотаций в виде электронной таблицы.
    3. Выберите модуль «Выражение» | Снимите модуль пакетного эффекта. Введите файл аннотации и объединенную матрицу и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы создать объединенную матрицу с удаленным пакетным эффектом (объединенная матрица 2).
  3. Нормализация данных выражений с помощью функций слияния наборов данных, пакетного эффекта и нормализации , доступных на платформе онлайн-анализа. Выберите модуль выражения и модуль нормализации. Входная объединенная матрица 2 создана на шаге 1.2.3. Нажмите кнопку «Выполнить ». (см. Таблицу материалов).
  4. Выведите файл матрицы выражений после выполнения всего процесса, описанного выше. Извлеките информацию о группировке в соответствии с вмешательством, представленным на веб-сайте ГЕО. Введите приведенную выше информацию в документ в формате «.txt», чтобы создать файл сведений о группировании для объединенного набора данных.

2. Дифференциальный анализ экспрессических генов

  1. Выполните дифференциальный анализ экспрессии генов с помощью пакета limma в R. Введите файл матрицы экспрессии и файл информации о группировке. Установите критерии фильтрации на |logFC| = 1 и p < 0,05 , чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые гены (DEG), связанные с рассеянным склерозом.

3. Анализ функционального обогащения (GO и KEGG)

  1. Проведение функционального анализа обогащения для DEG с помощью модулей GO и KEGG на онлайн-платформах.
    1. Модельный организм был установлен на Homo sapiens, с Ensemble_109 версией в качестве фонового файла генов и генами в качестве типа данных.
    2. Избегайте широких терминов GO; уточнить анализ с помощью ToppFun. Применяйте фильтры, чтобы ограничить термины до 500 и 1000 ассоциированных генов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты фильтрации 500 генов представлены в основной рукописи. Полные результаты GO доступны на дополнительном рисунке S2. Онлайн-платформа KEGG показана на дополнительном рисунке S3.

4. Анализ вариаций набора генов для ферроптоза и гипоксии (GSVA)

  1. Получите в общей сложности 538 генов, связанных с ферроптозом, из FerrDb и 200 генов, связанных с гипоксией, из MsigDB.
  2. Создание файлов в формате GMT для обоих наборов генов.
  3. Используйте модуль GSVA для вычисления Z-оценки ферроптоза и Z-оценки гипоксии для каждой выборки в объединенном наборе данных, а также используйте файл матрицы выражений, файл группирующей информации и файлы GMT в качестве входных данных.
  4. Сравните Z-баллы разных групп (дополнительный рисунок S4).

5. Взвешенный сетевой анализ коэкспрессии генов (WGCNA)

  1. Извлеките Z-показатель ферроптоза и гипоксии каждого образца, рассчитанный на шаге 4.4. Используйте приведенные выше Z-показатели ферроптоза и гипоксии в качестве файлов признаков вместе с файлами матрицы экспрессии, чтобы определить ключевые модули генов, связанные с ферроптозом и гипоксией.
  2. Используйте модуль WGCNA и установите R2 = 0,9 и мягкий порог β = 18 для построения взвешенной сети коэкспрессии генов. Сосредоточьтесь на модулях, в значительной степени связанных как с ферроптозом, так и с гипоксией (дополнительный рисунок S4).

6. Идентификация дифференциально экспрессируемых генов, связанных с ферроптозом и гипоксией у пациентов с РС

  1. Скрещивайте связанные с заболеванием ДЭГ с модулями генов, связанных с ферроптозом и гипоксией, с помощью инструмента диаграммы Венна на онлайн-платформе анализа (дополнительный рисунок S3). Определите гены, связанные как с ферроптозом, так и с гипоксией при рассеянном склерозе.

7. Анализ сети белок-белковых взаимодействий (ИПП)

  1. Введите пересеченные гены в модуль Multiple Proteins базы данных STRING.
  2. Установите для организма значение Homo sapiens и нажмите «Поиск».
  3. Используйте опцию CONTINUE в центре веб-страницы, чтобы создать сеть PPI.
  4. Экспортируйте информацию о сети взаимодействия в формат TSV и импортируйте ее в программное обеспечение для анализа биоинформационных сетей (дополнительный рисунок S5).
  5. Используйте плагин Cytohubba для определения топ-10 генов-хабов на основе алгоритма MCC.

8. Валидация с помощью набора данных GSE151306

  1. Скачайте набор данных GSE151306 из ГЕО.
  2. Используйте пакет limma в программном обеспечении R studio (коды языка R предоставлены в GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS) для проверки экспрессии генов-концентратора в различных группах, а также введите файл матрицы экспрессии, файл группировки проверочного набора и список генов хаба.

9. Построение ROC-кривой для генов-хабов

  1. Используйте пакет pROC в R для построения ROC-кривых для дифференциально экспрессируемых генов-хабов.
  2. Проверьте диагностическую ценность этих генов-концентраторов в наборе данных для проверки (коды языка R предоставлены в GitHub: https://github.com/Drxiazhang/Identification-of-Ferroptosis--and-Hypoxia-Related-Genes-in-iPSC-Derived-OPCs-from-MS).

10. Прогнозирование регуляторных сетей генов фактор-хаб транскрипции

  1. Получите доступ к базе данных TRRUST v2 по адресу https://www.grnpedia.org/trrust/.
  2. Используйте модуль Поиск ключевых регуляторов для запроса генов для определения факторов транскрипции, регулирующих 10 генов-хабов.
    1. Установите человека для вида. Введите факторы транскрипции и гены-концентраторы в модуль STRING Multiple Proteins , установите Homo sapiens для организмов и нажмите CONTINUE , чтобы создать регуляторную сеть.

Результаты

Объединенный набор данных, состоящий из четырех здоровых людей в контрольной группе и девяти человек с рассеянным склерозом (PwMS), был проанализирован, а затем проверен в другом наборе данных из четырех PwMS и четырех здоровых контрольных групп. Протокол анализа показан ...

Обсуждение

Учитывая его ключевую роль в процессе ремиелинизации, миграция, дифференцировка и гибель ОПК уже давно определены как решающие факторы патогенеза РС и терапевтические мишени РС. Независимая от воспаления прогрессирующая нервная дегенерация наблюдалась при всех тре...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих интересов, которые имеют отношение к содержанию данной статьи.

Благодарности

Это исследование было поддержано и профинансировано Национальным финансированием клинических исследований больниц высокого уровня (2022-PUMCH-B-103). Авторы хотели бы поблагодарить доктора Шуан Сонг (Shuang Song), факультет биостатистики, Гарвардская школа общественного здравоохранения им. Т. Х. Чана, Гарвардского университета, за ее ценные советы и рекомендации на этапе редактирования этой статьи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BioInfoTools/online analysis website http://biowinford.site:3838/patrick_wang87/
Cytoscape/bioinformatics network analysis software
GSE196575,GSE147315 and GSE151306/RNA-seq from GEO dataset
OmicshareGENE DENOVOonline analysis tools https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/getsoft
R-studioRStudio, IncR integrated development environment software

Ссылки

  1. Fünfschilling, U., et al. Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity. Nature. 485 (7399), 517-521 (2012).
  2. Nishiyama, A., et al. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nat Rev Neurosci. 10 (1), 9-22 (2009).
  3. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: from biology to therapy. Nat Rev Neurosci. 9 (11), 839-855 (2008).
  4. Lucchinetti, C., et al. A quantitative analysis of oligodendrocytes in multiple sclerosis lesions. A study of 113 cases. Brain. 122 (Pt 12), 2279-2295 (1999).
  5. Patrikios, P., et al. Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients. Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).
  6. Starost, L., et al. Extrinsic immune cell-derived, but not intrinsic oligodendroglial factors contribute to oligodendroglial differentiation block in multiple sclerosis. Acta Neuropathol. 140 (5), 715-736 (2020).
  7. Niu, J., et al. Aberrant oligodendroglial-vascular interactions disrupt the blood-brain barrier, triggering CNS inflammation. Nat Neurosci. 22 (5), 709-718 (2019).
  8. Plastini, M. J., et al. Transcriptional abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived oligodendrocytes of individuals with primary progressive multiple sclerosis. Front Cell Neurosci. 16, 972144 (2022).
  9. Pisa, M., et al. Subclinical anterior optic pathway involvement in early multiple sclerosis and clinically isolated syndromes. Brain. 144 (3), 848-862 (2021).
  10. Vidal-Jordana, A., et al. Optical coherence tomography measures correlate with brain and spinal cord atrophy and multiple sclerosis disease-related disability. Eur J Neurol. 27 (11), 2225-2232 (2020).
  11. Stockwell, B. R. Ferroptosis turns 10: Emerging mechanisms, physiological functions, and therapeutic applications. Cell. 185 (14), 2401-2421 (2022).
  12. Thamizhoviya, G., Vanisree, A. J. Enriched environment enhances the myelin regulatory factor by mTOR signaling and protects the myelin membrane against oxidative damage in rats exposed to chronic immobilization stress. Neurochem Res. 46 (12), 3314-3324 (2021).
  13. Williams, R., et al. Pathogenic implications of iron accumulation in multiple sclerosis. J Neurochem. 120 (1), 7-25 (2012).
  14. Stojkovic, L., et al. Targeted RNAseq revealed the gene expression signature of ferroptosis-related processes associated with disease severity in patients with multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 25 (5), 3016 (2024).
  15. Ziabreva, I., et al. Injury and differentiation following inhibition of mitochondrial respiratory chain complex IV in rat oligodendrocytes. Glia. 58 (15), 1827-1837 (2010).
  16. Aboul-Enein, F., et al. Preferential loss of myelin-associated glycoprotein reflects hypoxia-like white matter damage in stroke and inflammatory brain diseases. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (1), 25-33 (2003).
  17. Halder, S. K., Milner, R. Hypoxia in multiple sclerosis; is it the chicken or the egg. Brain. 144 (2), 402-410 (2021).
  18. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  19. Pisa, M., et al. Subclinical neurodegeneration in multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder revealed by optical coherence tomography. Mult Scler. 26 (10), 1197-1206 (2020).
  20. Lucchinetti, C., et al. Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelination. Ann Neurol. 47 (6), 707-717 (2000).
  21. Aboul-Enein, F., Lassmann, H. Mitochondrial damage and histotoxic hypoxia: a pathway of tissue injury in inflammatory brain disease. Acta Neuropathol. 109 (1), 49-55 (2005).
  22. Jhelum, P., et al. Ferroptosis mediates cuprizone-induced loss of oligodendrocytes and demyelination. J Neurosci. 40 (48), 9327-9341 (2020).
  23. Zhang, D., et al. Evidence of pyroptosis and ferroptosis extensively involved in autoimmune diseases at the single-cell transcriptome level. J Transl Med. 20 (1), 363 (2022).
  24. Luoqian, J., et al. Ferroptosis promotes T-cell activation-induced neurodegeneration in multiple sclerosis. Cell Mol Immunol. 19 (8), 913-924 (2022).
  25. Wu, T., et al. Role of ferroptosis in neuroimmunity and neurodegeneration in multiple sclerosis revealed by multi-omics data. J Cell Mol Med. 28 (10), e18396 (2024).
  26. Zeng, L., et al. Advances in research on immunocyte iron metabolism, ferroptosis, and their regulatory roles in autoimmune and autoinflammatory diseases. Cell Death Dis. 15 (7), 481 (2024).
  27. Neel, D. V., et al. Catching a killer: Mechanisms of programmed cell death and immune activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Immunol Rev. 311 (1), 130-150 (2022).
  28. Liu, L., et al. Ferritinophagy-mediated hippocampus ferroptosis is involved in cognitive impairment in immature rats induced by hypoxia combined with propofol. Neurochem Res. 49 (7), 1703-1719 (2024).
  29. An, S., et al. HIF-1α induced by hypoxia promotes peripheral nerve injury recovery through regulating ferroptosis in DRG neuron. Mol Neurobiol. 61 (9), 6300-6311 (2024).
  30. Wang, L., et al. CXCR2 antagonism promotes oligodendrocyte precursor cell differentiation and enhances remyelination in a mouse model of multiple sclerosis. Neurobiol Dis. 134, 104630 (2020).
  31. Merelli, A., et al. Understanding the role of hypoxia inducible factor during neurodegeneration for new therapeutics opportunities. Curr Neuropharmacol. 16 (10), 1484-1498 (2018).
  32. Huang, L., et al. miR19b-3p promotes the growth and metastasis of colorectal cancer via directly targeting ITGB8. Am J Cancer Res. 7 (10), 1996-2008 (2017).
  33. Li, J., et al. Exosomal circDNER enhances paclitaxel resistance and tumorigenicity of lung cancer via targeting miR-139-5p/ITGB8. Thorac Cancer. 13 (9), 1381-1390 (2022).
  34. Mazaheri, N., et al. Ameliorating effect of osteopontin on H2O2-induced apoptosis of human oligodendrocyte progenitor cells. Cell Mol Neurobiol. 38 (4), 891-899 (2018).
  35. Milner, R., et al. Fibronectin- and vitronectin-induced microglial activation and matrix metalloproteinase-9 expression is mediated by integrins alpha5beta1 and alphavbeta5. J Immunol. 178 (12), 8158-8167 (2007).
  36. Hrastelj, J., et al. CSF-resident CD4+ T-cells display a distinct gene expression profile with relevance to immune surveillance and multiple sclerosis. Brain Commun. 3 (3), fcab155 (2021).
  37. Yan, L., Cui, Z. Integrin β1 and the repair after nervous system injury. Eur Neurol. 86 (1), 2-12 (2023).
  38. Birkner, K., et al. β1-Integrin- and KV1.3 channel-dependent signaling stimulates glutamate release from Th17 cells. J Clin Invest. 130 (2), 715-732 (2020).
  39. Zhang, Q., et al. Sp1-mediated upregulation of Prdx6 expression prevents podocyte injury in diabetic nephropathy via mitigation of oxidative stress and ferroptosis. Life Sci. 278, 119529 (2021).
  40. Hadi, N., et al. Study of the correlation between miR-106a, miR-125b, and miR-330 on multiple sclerosis patients by targeting TNFSF4 and SP1 in NF-кb/TNF-α pathway: A case-control study. Cell J. 24 (7), 403-409 (2022).
  41. Asbelaoui, N., et al. Interplay between androgen and CXCR4 chemokine signaling in myelin repair. Acta Neuropathol Commun. 12 (1), 18 (2024).
  42. Kaddatz, H., et al. Cuprizone-induced demyelination triggers a CD8-pronounced T cell recruitment. Glia. 69 (4), 925-942 (2021).
  43. Wang, W., et al. CD8+ T cells regulate tumour ferroptosis during cancer immunotherapy. Nature. 569 (7755), 270-274 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

IPSCPI3K Akt mTOR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены