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要約

このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。

要約

神経発達障害(NDD)は、神経系機能の障害と関連していますが、分子レベルではよく理解されていません。単一の遺伝子によって引き起こされる離散的な障害は、非定型神経発達を促進するメカニズムを調査するためのモデルを提供します。脱ユビキチン化酵素(DUB)ファミリータンパク質をコードする遺伝子の変異体は、いくつかのNDDと関連していますが、これらの遺伝子変異体によって引き起こされる障害の病原性メカニズムを決定する必要があります。DUB活性に対する遺伝子変異体の影響は、基質に依存しない in vitro ユビキチン切断アッセイを用いて実験的に決定することができます。このアッセイでは、触媒活性を直接測定するために下流の基質に関する知識は必要ありません。ここでは、遺伝子変異体が酵素活性に及ぼす影響を決定するためのプロトコルは、X連鎖性知的障害105(XLID105)で変異したDUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked(USP27X)を用いてモデル化される。この実験パイプラインは、DUB遺伝子の変異によって引き起こされる神経発達障害の根底にあるメカニズムを明らかにするために使用できます。

概要

神経発達障害(NDD)は、非定型神経系の発達を促進する環境的または遺伝的決定要因を持つさまざまな病因から発生します1。次世代シーケンシング遺伝子検査により、ユビキチン系関連遺伝子の変異体が遺伝的NDDと関連して増加していることが明らかになりました2。ユビキチンシステムは、低分子タンパク質修飾因子ユビキチンが主にタンパク質基質のリジン残基にライゲーションするのを触媒し、局在化、安定性、タンパク質間相互作用、活性などの細胞挙動の変化を促進します3。ユビキチン化は、E1活性化酵素、E2結合酵素、およびE3リガーゼ酵素4 によって媒介され、タンパク質基質5からのユビキチンの切断と除去を触媒する脱ユビキチン化酵素(DUB)の活性によって可逆的である。ユビキチンは、7つのリジン残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)またはユビキチンのM1残基のいずれかに形成されるモノマー(モノユビキチン化)またはポリマー鎖(ポリユビキチン化)として基質にライゲーションすることができます。これらの異なるユビキチン鎖トポロジーとその組み合わせは、シグナル伝達の鍵となる細胞コードを作り出す6。<....

プロトコル

以下のプロトコルは、コンピテントセルの異なる株で発現する種々のアフィニティータグを用いた組換えタンパク質に適合させることができます。発現するタンパク質によっては、培養条件および一晩の発現条件で、発現誘導、発現時間、発現温度、およびIPTG濃度でのOD600 の最適化が必要になる場合があります。プロトコルの概要を 図 1 に示します。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1. コンピテントRosetta 2 E. coli細胞の組換えGST-USP27X発現プラスミドによる形質転換

注:細菌培養物の無菌性を維持するために、培地容器がブンゼンバーナー炎の下で開いている場所で手順を実行してください。最適な酸素移動を可能にするために、軌道19mmから50mm、速度200rpm29のベンチトップ温度制御シェーカーで細菌培養振とうを行います。

  1. 使用直前に、化学的にコンピテントな Rosetta 2 E. coli 細胞20 μLを氷上で解凍します。....

代表的な結果

XLID105随変異体がUSP27X触媒活性に及ぼす影響を調べるため、GSTタグ付き野生型USP27XとXLID105随伴変異体F313V、Y381H、およびS404N USP27Xタンパク質を細菌から精製しました。これらの変異体は、USP27XのUSP触媒ドメイン内に位置しています(図2A)。USP27Xは以前にK63ユビキチン鎖を切断することが報告されていたため31、野生型USP27XおよびXLI.......

ディスカッション

この記事では、組換えUSP27X DUBの発現と精製のためのプロトコールと、野生型USP27XとNDD関連バリアントタンパク質の脱ユビキチン化活性を比較するための in vitro ユビキチン鎖切断アッセイについて紹介します。このアッセイにより、XLID105関連変異体がUSP27X触媒活性を破壊することが決定されました7。このメカニズムの洞察は、XLID105をUSP27X機?.......

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、Sanford ResearchのスタートアップファンドからFBに、NIHの助成金R01CA233700 MJSから資金提供を受けました。アートワークはフェリペ・G・セラーノ(www.illustrative-science.com)が担当しました。GST-USP27Xプラスミドを提供してくださったGreg Findlay博士(ダンディー大学)に感謝いたします。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PKCytiva10600041
Ammonium sulfateFisher ScientificAC205872500
AmpicillinFisher ScientificBP1760 25
Anti- Ubiquitin (Mouse monoclonal)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Sheep polyclonal)MRC-PPU Reagents and ServicesCat# S902A Third bleed(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Baffled Culture Flasks 2 LFisher Scientific10-042-5N
Bradford ReagentMillipore SigmaB6916-500ML
ChloramphenicolGold BiotechnologyC-105-25
Complete, Protease Inhibitor tabletsMillipore Sigma5056489001
Econo-Column 1.5 × 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
GlycerolGenesee Scientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 well gelThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Secondary AntibodyLI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Isotemp Digital Dry BathFisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB AgarGenesee Scientific11-119
LB BrothGenesee Scientific11-118
LysozymeGold BiotechnologyL-040-100
MaxQ 4000 Benchtop Orbital ShakerThermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Running BufferBoston Bioproducts IncBP-177
Mini Tube RotatorFisher Scientific88-861-051
NuPage LDS Sample buffer 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Odyssey Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 human USP27XMRC-PPU Reagents and ServicesDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404NAddgene225717Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381HAddgene225716Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)Gold BiotechnologyP-470-10
Polysorbate 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Competent CellsMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
Sodium chlorideGenesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Sorvall RC 6 Plus CentrifugeThermo Fisher Scientific46910
TCEP (Tris-(carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Gold BiotechnologyTCEP10
Terrific Broth PowderGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Thermo Fisher ScientificEI0002

参考文献

  1. Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -. A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E.

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