Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

Intisar Koch; Matthew J. Schellenberg; Francisco Bustos

doi:10.3791/67367

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Method Article

Misurazione dell'attività enzimatica degli enzimi deubiquitilanti associati a disturbi dello sviluppo neurologico tramite un saggio in vitro di scissione della catena dell'ubiquitina

DOI:

10.3791/67367

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September 27th, 2024

Intisar Koch¹, Matthew J. Schellenberg², Francisco Bustos¹^,³

¹Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, ²Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, ³Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

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Riepilogo

Questo protocollo spiega come misurare l'effetto della variazione genetica associata ai disturbi dello sviluppo neurologico sull'attività dell'enzima deubiquitilante combinando la purificazione di proteine ricombinanti con saggi di scissione della catena dell'ubiquitina.

Abstract

I disturbi del neurosviluppo (NDD) sono associati a menomazioni della funzione del sistema nervoso, ma spesso rimangono poco compresi a livello molecolare. I disturbi discreti causati da singoli geni forniscono modelli per studiare i meccanismi che guidano lo sviluppo neurologico atipico. Varianti di geni che codificano per proteine della famiglia degli enzimi deubiquitilanti (DUB) sono associate a diverse NDD, ma è necessario determinare i meccanismi patogenetici dei disturbi guidati da queste varianti geniche. L'impatto delle varianti geniche sull'attività del DUB può essere determinato sperimentalmente utilizzando un saggio di scissione dell'ubiquitina in vitro indipendente dal substrato. Questo test non richiede la conoscenza dei substrati a valle per misurare direttamente l'attività catalitica. Qui, il protocollo per determinare l'impatto delle varianti geniche sull'attività enzimatica è modellato utilizzando la proteasi specifica per l'ubiquitina DUB 27, legata all'X (USP27X), che è mutata nella disabilità intellettiva legata all'X 105 (XLID105). Questa pipeline sperimentale può essere utilizzata per chiarire i meccanismi alla base dei disturbi dello sviluppo neurologico guidati da varianti nei geni DUB.

Introduzione

I disturbi del neurosviluppo (NDD) derivano da diverse eziologie con determinanti ambientali o genetici che guidano lo sviluppo atipico^del sistema nervoso 1. I test genetici di sequenziamento di nuova generazione hanno collegato un numero crescente di varianti nei geni correlati al sistema dell'ubiquitina con le NDD genetiche². Il sistema dell'ubiquitina catalizza la legatura del piccolo modificatore proteico ubiquitina principalmente ai residui di lisina nei substrati proteici per guidare i cambiamenti nel comportamento cellulare, tra cui la localizzazione, la stabilità, le interazioni ....