Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, rekombinant protein saflaştırmasını ubikitin zincir bölünme deneyleri ile birleştirerek nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genetik varyasyonun deubikitile edici enzim aktivitesi üzerindeki etkisinin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Özet

Nörogelişimsel bozukluklar (NDD'ler) sinir sistemi fonksiyonundaki bozukluklarla ilişkilidir, ancak genellikle moleküler düzeyde tam olarak anlaşılamamıştır. Tek genlerin neden olduğu ayrık bozukluklar, atipik nörogelişimi yönlendiren mekanizmaları araştırmak için modeller sağlar. Deubikitile edici enzim (DUB) ailesi proteinlerini kodlayan genlerin varyantları birkaç NDD ile ilişkilidir, ancak bu gen varyantları tarafından yönlendirilen bozuklukların patojenik mekanizmalarının belirlenmesine ihtiyaç vardır. Gen varyantlarının DUB aktivitesi üzerindeki etkisi, substrattan bağımsız bir in vitro ubikitin bölünme testi kullanılarak deneysel olarak belirlenebilir. Bu tahlil, katalitik aktiviteyi doğrudan ölçmek için aşağı akış substratları hakkında bilgi gerektirmez. Burada, gen varyantlarının enzimatik aktivite üzerindeki etkisini belirleme protokolü, X'e bağlı zihinsel engellilik 105'te (XLID105) mutasyona uğrayan DUB Ubiquitin Spesifik Proteaz 27, X'e bağlı (USP27X) kullanılarak modellenmiştir. Bu deneysel boru hattı, DUB genlerindeki varyantlar tarafından yönlendirilen nörogelişimsel bozuklukların altında yatan mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Nörogelişimsel bozukluklar (NDD'ler), atipik sinir sistemi gelişimini yönlendiren çevresel veya genetik belirleyicileri olan çeşitli etiyolojilerden kaynaklanır1. Yeni nesil dizileme genetik testleri, ubikitin sistemi ile ilgili genlerde artan sayıda varyantı genetik NDD'lerle ilişkilendirmiştir2. Ubikuitin sistemi, lokalizasyon, stabilite, protein-protein etkileşimleri veya aktivite3 dahil olmak üzere hücresel davranıştaki değişiklikleri yönlendirmek için küçük protein değiştirici ubikuitinin protein substratlarındaki lizin kalıntılarına bağlanmasını katalize ede....

Protokol

Aşağıdaki protokol, yetkin hücrelerin farklı suşlarında eksprese edilen çeşitli afinite etiketleri kullanılarak rekombinant proteinler için uyarlanabilir. İfade edilen proteine bağlı olarak, kültürleme ve gece ekspresyon koşulları, OD600'ün ekspresyon indüksiyonu, ekspresyon süresi, ekspresyon sıcaklığı ve IPTG konsantrasyonunda optimizasyonunu gerektirebilir. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yetkili Rose....

Temsili Sonuçlar

XLID105 ile ilişkili varyantların USP27X katalitik aktivitesi üzerindeki etkisini belirlemek için, GST etiketli vahşi tip USP27X ve XLID105 ilişkili varyant F313V, Y381H ve S404N USP27X proteinleri bakterilerden saflaştırıldı. Bu varyantlar, USP27X'in USP katalitik alanı içinde bulunur (Şekil 2A). USP27X'in daha önce K63 ubikitin zincirlerini31 parçaladığı bildirildiğinden, vahşi tip USP27X ve XLID105 ilişkili var.......

Tartışmalar

Bu makale, rekombinant USP27X DUB'ların ekspresyonu ve saflaştırılması için bir protokol ve vahşi tip USP27X ve NDD ile ilişkili varyant proteinlerin deubikitile edici aktivitesini karşılaştırmak için bir in vitro ubikitin zincir bölünme testi sunar. Bu tahlil, XLID105 ilişkili varyantların USP27X katalitik aktivitesinibozduğunu belirledi 7. Bu mekanik içgörü, XLID105 USP27X fonksiyonel bozulma bozukluğu olarak tanımlamamıza yardı.......

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sanford Research başlangıç fonları tarafından FB'ye ve NIH hibe R01CA233700 MJS'ye finanse edildi. Sanat eseri Felipe G. Serrano (www.illustrative-science.com) tarafından yapılmıştır. GST-USP27X plazmidi için Dr. Greg Findlay'e (Dundee Üniversitesi) teşekkür ederiz.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PKCytiva10600041
Ammonium sulfateFisher ScientificAC205872500
AmpicillinFisher ScientificBP1760 25
Anti- Ubiquitin (Mouse monoclonal)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Sheep polyclonal)MRC-PPU Reagents and ServicesCat# S902A Third bleed(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Baffled Culture Flasks 2 LFisher Scientific10-042-5N
Bradford ReagentMillipore SigmaB6916-500ML
ChloramphenicolGold BiotechnologyC-105-25
Complete, Protease Inhibitor tabletsMillipore Sigma5056489001
Econo-Column 1.5 × 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
GlycerolGenesee Scientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12 well gelThermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Secondary AntibodyLI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Isotemp Digital Dry BathFisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB AgarGenesee Scientific11-119
LB BrothGenesee Scientific11-118
LysozymeGold BiotechnologyL-040-100
MaxQ 4000 Benchtop Orbital ShakerThermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS Running BufferBoston Bioproducts IncBP-177
Mini Tube RotatorFisher Scientific88-861-051
NuPage LDS Sample buffer 4xThermo Fisher ScientificNP0007
Odyssey Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 human USP27XMRC-PPU Reagents and ServicesDU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404NAddgene225717Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381HAddgene225716Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)Gold BiotechnologyP-470-10
Polysorbate 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Competent CellsMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
Sodium chlorideGenesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Sorvall RC 6 Plus CentrifugeThermo Fisher Scientific46910
TCEP (Tris-(carboxyethyl) phosphine hydrochloride)Gold BiotechnologyTCEP10
Terrific Broth PowderGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Thermo Fisher ScientificEI0002

Referanslar

  1. Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -. A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N rogeli imsel BozukluklarEnzimatik AktiviteDeubikitile Edici EnzimlerGen VaryantlarPatojenik MekanizmalarDUB Ailesi ProteinleriUbikitin B l nme DeneyiKatalitik AktiviteUSP27XX e Ba l Zihinsel EngellilikXLID105Deneysel Boru Hatt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır