この研究は、若手研究（）（＃16680015）、萌芽研究（＃16653065）、特定領域研究（＃18023022、＃費補助金のための - 補助の補助金によって支えられて教育、文化、スポーツ、科学、および日本における技術省から18016012と＃18053015）、医薬基盤研究所（NIBIO）の健康科学の基礎的研究の推進から、補助金、助成インニューロインフォマティクス日本センター（NIJC）、理研からの援助

<ol><li>明/暗移行試験に用いる装置は、ドアとパーティション（大原アンドカンパニー、東京）で同じサイズの2つのセクションに分かれてケージ（21x42x25センチ）から成っていた。 </li><li>マウスは、食物と水にアドリブでアクセス権を持つ12時間の明/暗サイクル（午前7時点灯）で部屋にケージに3〜4を収容している。理想的には、2つのコントロールと2つの変異体は、すぐにそれらは離乳時に遺伝子型をしているとマウスを再組織し、一緒に収容されている。行動試験は、午前9:00の間で行われ、最初の試験が始まる前に、マウスを含む全てのケージが動作テストの部屋に30分を転送しているPM 6:00です。 </li><li>他のチャンバー（2ルクス）暗であるのに対し、一つのチャンバは、明るく、白色ダイオード（390ルクス）で点灯します。マウスは、ダークサイドに配置され、マウスは赤外線カメラによって検出された後、ドアが自動的に3秒を開かれます。光チャンバーを入力してレイテンシが不安のような行動の指標になりうる可能性があるのでドアが、マウスは実験者から逃れるために彼らの動機とリリースの直後に光チャンバーを入力しないようにするために使用されます。 </li><li>マウスは、10分間オープンドアを持つ二つの部屋間を自由に移動することが許可されます。行動データ（画像LD4）を取得し、分析に使用されるアプリケーションは、パブリックドメインの画像Jプログラム（国立精神衛生研究所でbyWayne Rasbandを開発し、http://rsb.info.nih.gov/ijで入手可能に基づいています。剛宮川（オハラアンドカンパニー、東京、日本から利用可能）によって変更された/）、。 </li><li>距離は、各チャンバー内遷移の合計数、各チャンバー内で費やされた時間、および画像LD4プログラムによって記録された光chamberareを入力してレイテンシを旅した。 </li><li>各試行の後、すべてのチャンバは嗅覚手がかりに基づいてバイアスを防ぐために、スーパー次亜塩素水で洗浄されています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

すべての手順は、京都大学の動物の利用とケア委員会によって承認された。剛宮川は、BIRD、日本科学技術振興機構、埼玉県、日本に関連付けられています。

マウスのゲノム配列のすべてが決定されているが、これらの遺伝子のほとんどの機能は知られていない。技術を遺伝子標的、しかし、マウスの特定の遺伝子を削除したり操作するために使用することができます（相葉ら、2007;。。Aust​​inら、2004）。特定の行動上の特定の遺伝子の影響は、その後、変異マウスの行動解析を行うことによって決定することができる（高尾と宮川、2006;高尾らは、2007年。）。変異マウスの行動表現型解析のためのテストとして、ダーク/ライト遷移テストは、マウスの動作（ローリー、2000）のような不安を測定するために最も広く使用されている試験の一つです。テストは、明るく照らされた領域へのマウスの自然な嫌悪感にと新たな環境で彼らの自発的な探索行動（ローリー、1985）に基づいています。テストは、抗不安薬の治療（ローリー、1985）に敏感です。装置は、暗室と明るく照明室で構成されています。 5センチメートル広い3センチの高さ制限されたオープニングは、2つのチャンバーを接続します。マウスは2つのチャンバー間を自由に移動することが許可されます。明るい室と時間の期間内のエントリの数は、マウスで明るい空間不安の指標として、そこに使用されて過ごした。 ダーク/ライト遷移テストは、もともとローリーと同僚（クローリーとグッドウィン、1980）によって開発されました。元のバージョンと我々のテストの間に2つの違いがあります。二つの部屋の大きさは、テストの我々のバージョンで同じであるのに対し、最初に、光室は、オリジナルバージョンの暗室よりも大きいです。第二に、オリジナルバージョンでは、光室は天井がなく、我々は光室の天井と壁のために不透明な白いプラスチックを使用しながら、光室の壁は、透明であった（クローリーとグッドウィン、1980）。これらの違いは、すなわち光室の大きさと開放性は、同時明るい空間不安の検出だけでなく、テストの元のバージョンのオープンスペースの不安を可能にする。当研究室では、しかし、オープンスペースマウスの不安様行動は高架式十字迷路でテストされます。不透明な壁と天井、光室の大きさ、そして私たちの特定の光/闇遷移テストのプロトコルは、元のバージョンに比べて明るい空間不安を検出するための、より特化です。 ダーク/ライト遷移テストと高架式十字迷路は両方不安様行動を評価するために使用されますが、結果は必ずしも一貫性がありません。例えば、前脳特異的カルシニューリンノックアウトマウスは、光/闇遷移テストに光室での時間の減少量を過ごすが、高架式十字迷路のオープンアームでの時間の増加量（宮川ら、2003） 。我々は、明/暗移行テストと高架式十字迷路試験はそのような明るい空間不安とオープンスペースの不安のような振る舞いのような不安のような振る舞いの異なる側面を、評価するという仮説を立てた。この仮説をテストするには、我々は、大規模なデータの両方のテストで同じマウスを使用して収集された設定を使用していました。当研究室では、我々は遺伝子の行動の重要性をスクリーニングするために多くのドメインをカバーする行動テストバッテリーを行う。テストバッテリーの寿命は数週間が完了する必要があります。テスト期間中は、マウスのケージは、私たちの施設でラックに保持されます。マウスが他の機関から研究室に輸送されている場合、それらは少なくとも1週間のために私たちの施設の環境に慣れています。馴化期間の後、マウスは、一般的なヘルスチェックと神経学的スクリーニング（宮川ら、2003）に供される、およびこれらの簡単な検査の後、マウスは明/暗移行試験に供されています。映画に示すように、テストは、実験室への慣れの30分後の防音実験室で行われている。 我々は映画に示されているプロトコルを使用して、遺伝子組み換え変異マウスの60以上の系統を評価し、3000以上のマウス（野生型と変異マウスを含む）のための生データの大きなセットを持っている。我々は、生データの大きなセットを活用するために因子分析を行った。インデックス（未発表データ）の間にいくつかの有意な相関があったものの、実際、我々は、各試験（未発表データ）から別の要因を検出..これらのデータは、我々が今構築している公的データベースの一部として開示されます。 我々のテストバッテリーでは、野生型の同腹子は、通常、コントロールとして使用されます。背景の株として、C57BL/6Jマウスは、一般的に使用されています。我々はテスト電池の変異マウスのコントロールとして使用されるC57BL/6Jマウスのデータを収集した。私たちの光/闇遷移テストでC57BL/6Jマウスから得られた指標は、（;平均SEM、N = 795）、以下の通りであった走行距離：光室で846.5 8.88センチメートル、暗室で1478.5 9.53センチメートルを、時間の持続時間は費やして：光の215.8 1.85秒、暗闇の中で395.8 1.86秒、コンパートメント間の遷移の数：30.52 0.43;光チャンバーを入力してレイテンシ：64.94 2.40秒チャンバーへの入り口付近マウスの動きはカメラによって検出され、cの両方に費やされる時間としてカウントされますhambers。このため、時間の平均期間の合計は、光の中で過ごし、暗闇のコンパートメントで試験の全期間（600秒）よりも大きかったこと。 我々のプロトコルでは、マウスが最初に暗い部屋に置かれている。 3秒暗室でマウスを配置した後、チャンバーの間にドアが自動的に開き、マウスは2つのチャンバー間を自由に移動できます。 215.8 1.85秒、暗闇の中で過ごした時間の長さ：316.3 2.11秒[時間暗所で過ごした行うC57BL/6Jマウスは、（P &lt;0.0001、持続時間は、光の中で過ごした場合暗室よりも光室に少ない時間を過ごす初めて光室]、N = 795、ペア- t検定）を入力する前に暗闇の中で過ごした最初の時間は含まれません。これは、C57BL/6Jマウスは光チャンバーを避ける傾向にあることを示し、そして光の中で費やされた時間が不安のような振る舞いのよい指標であること。 すべてのデータが同じプロトコルを使用して取得されるので、変異マウスの様々な株から得られた結果は、簡単に、比較されます。容易に再現し、他の変異体のデータと比較することができる変異マウスの系統の結果を表現型取得するには、行動試験法は、研究室間で可能な限り同じにする必要があります。クラッブと同僚は、全く同じ近交系とのnull変異株を用いて、マウスの行動と実験環境間の相互作用を試験した。彼らの研究では、装置、テストプロトコル、および多くの環境変数は、厳密に標準化した。彼らはまた、すべてのビヘイビア（クラッブら、1999）における系統差を検出したものの、標準化にもかかわらず、彼らは、研究室間の行動における体系的な違いを見つけた。彼らは変異体を特徴づける手に負えないの変数との実験は、特定の研究室に特異な結果をもたらす可能性があることを報告した。研究室間に存在する手続き型の違いは、それが困難な研究室間の結果を複製または比較すること。プロトコルの詳細を示すことができるように、ここで、私たちは映画のような光/闇の移行テストのための我々のプロトコルを示す。 プロトコルの視覚的なドキュメントを確立することは研究室間および変異マウスの様々な系統の行動表現型の比較のために使用されるプロトコルの標準化を可能にする、実験手順の詳細についての理解を促進するこのテストを用いて評価されます。そのような我々の行動テストバッテリーで使用する高架式十字迷路、オープンフィールド試験、porsolt強制水泳試験、恐怖条件付け、用など、他のプロトコルの作品は現在、将来のビデオ雑誌記事などの出版物のために作られている。

light/dark transition test for mice

マウスのゲノム配列のすべてが決定されているが、我々はまだこれらの遺伝子のほとんどの機能を知らない。技術を遺伝子標的、しかし、マウスの特定の遺伝子を削除したり操作するために使用することができます。特定の行動上の特定の遺伝子の影響は、変異マウスの行動解析を行うことによって決定することができます。変異マウスの行動表現型解析のためのテストとして、ダーク/ライト遷移テストは、マウスの不安様行動を測定するために最も広く使用されている試験の一つです。テストは、明るく照らされた領域へのマウスの自然な嫌悪感にと小説の環境で自発的探索行動に基づいています。テストは、抗不安薬の治療に敏感です。装置は、暗室と明るく照明室で構成されています。マウスは2つのチャンバー間を自由に移動することが許可されます。明るい室と時間の期間内のエントリの数は、マウスで明るい空間不安の指標がある過ごした。容易に再現し、他の変異体のものと比較することができる変異マウスの系統の結果を表現型取得するには、行動試験法は、研究室間で可能な限り同じにする必要があります。研究室間に存在する手続き上の違いは、しかし、それは困難な研究室間の結果を複製または比較すること。プロトコルの詳細を示すことができるように、ここで、私たちは映画のような光/闇の移行テストのための我々のプロトコルを示す。当研究室では、我々は映画に示されているプロトコルを使用して、変異マウスの60以上の株を評価している。これらのデータは、我々が今構築している公的データベースの一部として開示されます。 プロトコルの可視化は、変異マウスの様々な系統の行動表現型の研究室との比較を介して使用されるプロトコルの標準化を可能にする、全体の実験手順の詳細についての理解を容易にするこのテストを用いて評価。

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Light/dark Transition Test for Mice

ダーク/ライト遷移テストは、マウスの不安様行動を測定するために最も広く使用されている試験の一つです。ここで、我々はテストを行う方法についての詳細な手順を示して映画を紹介。

マウス用ダーク/ライト遷移テスト

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

51.7K ビュー.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. ダーク/ライト遷移テストは、マウスの不安様行動を測定するために最も広く使用されている試験の一つです。ここで、我々はテストを行う方法についての詳細な手順を示して映画を紹介。

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Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

マウス用高架式十字迷路

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

生物学

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

パーキンソン病モデルマウス：6 - OHドーパミンの病変から行動試験に

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

遺伝的関連の機能的基準をテストするための対立遺伝子特異的遺伝子発現アッセイ

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

間葉転換を誘導し、上皮の分析

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

最適STORM超解像顕微鏡のためのテストサンプル

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.