1. 準備

1. 始め始めの前に、実験室の手袋と適切な防護服を着用してください。
2. すべての解剖ツールを殺菌し、まず洗剤で、次に70%のエタノールで乾燥させ、その後完全に乾燥させます。
3. 2%の胎児子牛血清(FCS)を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS)の50mLを調調します。

2. 解剖

1. 二酸化炭素送達システムを用いて、低酸素症でマウスを安楽死させる。サパンの位置の解剖プレート上で安楽死マウスを固定し、はさみと鉗子を使用して縦開腹術を行います。
2. 鉗子を使用して、腹部の右側に腸と胃を動かして胃と脾臓を露出させる。脾臓は胃に付着している。
3. 鉗子を使用して、慎重に胃から脾臓を取り外し、HBSS 2%FCSの5mLを含むペトリ皿に入れます。

3. 免疫細胞分離

1. 脾臓を40μmのセルストレーナーに置き、同じペトリ皿の上に置きます。脾臓をプランジャーでつぶし、同じ皿に切り離します。
2. 解離された脾臓と流体を15mL遠心管に移します。
3. 10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離し、ペレットを避け、上清を廃棄します。
4. 赤血球をlyseseにアセテートカリウムの2mLで再濁させる。2 分間待ってから、HBSS 2% FCS を使用して最大 15 mL の音量を構成します。
5. 10°Cで7分間370 x gでチューブを再度遠心分離します。上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの5mLでペレットを再懸濁します。
6. トリパンブルー染色アッセイを用いて細胞をカウントし、HBSS 2%FCSの適切な体積を使用して、最終的な細胞濃度を10⁷細胞/mLに調整します。

4. 細胞染色

1. 細胞懸濁液の200μLを6本のFACSチューブに移し、1〜6の標識を付ける。
2. 10°Cで7分間370 x gでチューブを遠心分離し、ペレットを避けて上清を廃棄します。
3. 次に、表1に従って200μL HBSS 2%FCSに適切な量の抗体を添加して6種類の新規抗体混合物を調出す。
4. 次に、これらの抗体混合物を対応する番号付きFACSチューブに移す。
5. 細胞懸濁液を暗闇の氷上で20分間混合してインキュベートする。
6. 各チューブにHBSS 2%FCSの1mLを追加し、10°Cで3分間370 x gで再び遠心分離機を追加します。
7. 上清を廃棄し、HBSS 2%FCSの200μLでペレットを再懸濁する。
8. 再懸濁ペレットを新しいFACSチューブに移します。

表1:抗体混合組成物。200μLのHBSS+抗体の6つの混合物を試験用に調製した。ミックス1はPMT設定用、ミックス2~5は補償設定用、ミックス6はセルソート用です。

5. FACSキャリブレーション

1. まず、ソーターをオンにして「流体スタートアップ」を実行します。
2. ストリームをオンにしてから、ストリームが安定するまで 15 分間待ちます。
3. ストリームの振幅を調整して、離れたドロップ形成を取得します。次に、「スイート スポット」をクリックして振幅調整を完了します。
4. ニュートラル密度(N.D.)フィルタ-1.0を入れ、サイトメーターの設定とトラッキングを表す「CST」インターフェースを開きます。
5. 毎日の品質管理を実行するには、まず製造元の指示に従って FACS メディアで CST ビーズを希釈し、次に CST 制御を実行します。
6. CST 制御が完了したら、N.D. 1.0 フィルターをサイトメーターの N.D. 2.0 フィルターに置き換えます。
7. 次に、製造元の指示に従って FACS 媒体でドロップ遅延ビーズを希釈し、FACS にロードします。
8. 適切な並べ替えがドロップ遅延を実行するようにするには -
   1. 最初に「電圧」をクリックし、次に「光フィルタ」をクリックします。右の象限は 100% に等しくする必要があります。必要に応じて、サイトメーターの左右の赤いレーザーネジを調整して、右象限で100%を得る。
   2. 次に、テストソートを実行して、ストリームが収集チューブに入っていることを確認します。これを行うには、[廃棄物の引き出し]をクリックし、[テストソート]を開始します。サイドストリームが収集チューブに入っていることを確認します。そうでない場合は、電圧を調整します。
   3. 実験テンプレートに移動します。次に、「Accudrop ドロップ遅延」の実験を開き、「並べ替えレイアウト」をクリックします。
   4. 流量を変更して、1 秒あたり 1000 ~ 3000 イベントを取得します。
   5. [電圧]をクリックし、[光フィルタ]をクリックします。左側の象限は 0 に、右の象限は 100 に等しくする必要があります。
   6. [レイアウトの並べ替え]ウィンドウで [並べ替え]をクリックし、[キャンセル]をクリックします。左側の象限は 100 に、右の象限は 0 に等しくする必要があります。左象限が95未満の場合は、自動的に調整するために「自動遅延」をクリックします。

6. フローサイトメトリーと純度制御

1. チューブ1(染色されていない細胞)から始めてフローサイトメトリーを開始し、細胞形態とフルオロクロムの負のピークを定義する。前方および側面散乱を設定し、各蛍光パラメータの電圧を定義します。各ドット プロットのグリッドを使用して、最初の 10 年間に負の母集団を配置します。
2. 次に、サイトメーターにチューブ2(単色制御)をロードする。負の母集団中央値と正の母集団中央値が整列するか、自動計算ソフトウェアを使用するまで、スペクトルの重なりを調整します。信号をスケールに保つことが重要です。補正コントロールは、実験用フルオロクロムと検出器の設定と一致する必要があります。10,000 イベントを記録します。
3. チューブ 3、4、および 5 (その他の単一カラー コントロール) でこれらの手順を繰り返します。
4. 次に、チューブ6(多染色細胞)をロードし、特定のゲーティング戦略を用いて目的の細胞集団を定義する。
5. [レイアウトの並べ替え] ウィンドウで、対象のセルの人口を選択します。「ターゲットイベント」でセルしきい値を選択し、「精度」で精度レベルを選択します。ここでは 1 つの母集団のみが並べ替えられていますが、4 つの異なる母集団を同時に並べ替えることができます。
6. 準備ができたら、"並べ替え"と"OK"をクリックし、セルの並べ替えを待ちます。
7. 細胞の選別が完了したら、HBSS 2%FCSの90マイクロリットルの新しいFACSチューブに10μLのソートされた細胞を最初にピペッティングして純度制御を行います。
8. 次に、チューブにサイトメーターをロードします。セルの表現型を記録および分析し、ゲーティング戦略が意図したとおりに機能したことを確認します。

7. データ分析

1. 「FlowJo」ソフトウェアを開き、「すべてのサンプル」ウィンドウで各チューブのファイルをドラッグします。
2. ファイルをダブルクリックして、新しいウィンドウで開きます。
3. 「ポリゴン」をクリックし、以前に使用したゲーティング戦略を再作成します。
4. 他のすべてのファイルで手順を繰り返します。
5. ドットプロットを視覚化するには、「レイアウトエディタ」をクリックし、チューブ6から関心のある集団をドラッグし、レイアウトエディタタブで純度コントロールをドラッグします( セルは、純度コントロールに関心のある集団にのみ表示されます)(図2参照)。
6. 選別された細胞内のBリンパ球の純度を確認するには、「テーブルエディタ」をクリックしてください。チューブ6からBリンパ球集団をドラッグし、テーブル内の純度コントロールを行います。
7. [統計]メニューで CD45⁺セルの頻度を選択して、この細胞集団の純度をテストし、[テーブルを作成]をクリックします。
8. パラメータ値は新しいテーブルに表示されます。純度制御ウィンドウで、CD45+細胞内のBリンパ球の頻度を確認し、98%より高くする必要があります(図2、下パネル参照)。