このプロトコルは、研究所デBiologie物理Chimique、パリ、フランスでのフランシス=アンドレウォルマンの研究室で学んだ手法に基づいています。著者は、もともとクラミドモナス遺伝学的手法にDBSを導入したジャクリーンジラールBascou、に感謝の負債を負う。著者らの研究室でのクラミドモナスの研究は全米科学財団賞MCB - 0646350でサポートされている。

パート1：配偶子形成のための菌株の調製注：すべての操作は室温で実施すべきである。より高いまたはより低い温度では、受精卵発芽の速度に影響を与えると生存率に悪影響を及ぼす場合があります。 重要な考慮事項：交尾する菌株が確実に成長し、菌類や細菌を汚染の自由にされることが不可欠です。株は定期的に転送されていない場合、リッチな培地上で継代は、配偶子の世代の前にしてください。 <ol><li>交尾する菌株は、TAPのプレート（100 × 15 mm）を、プレートに1〜2株に転写されています。細胞は幅約1cmの集中ストリップで栽培する必要があります。 </li><li>確実に成長している細胞の厚い層が存在するまで、TAPプレート上でインキュベートすると、中間の転送必要に応じて、継続すべきである。定期的な使用中の野生型株が数日とない通路のみがかかる場合があります一方、最近では継代されていない株は、一つの通路と1週間の合計が必要な場合があります。光に敏感な変異体はさらに時間が必要になる場合があります。 </li><li>窒素欠乏していると配偶子形成を誘導し始めるN10の板、にTAPプレートからすべてのセルを転送します。彼らは、TAPのプレート上に存在していたのと同様、厚いスラブとしてセルを転送します。これは、細胞のその後のコレクションを容易にするでしょう。 N10で3日後、細胞は配偶子形成を受けるために準備されています。細胞分裂は、N10上で遅くなる、しかし、細胞は暗緑色のままにしてください。実行可​​能な接合体が得られないので汚染された菌株は破棄されるべきである。 </li></ol>パート2：嵌合<ol><li>各菌株は、50 mL三角フラスコに移し、約2.5 mlの滅菌蒸留水に再懸濁されている。これは、どちらワイヤループまたは滅菌スティックを使用して行うことができます。重要なのは細胞がよくまとまって中断していないということです。水の正確な量は、目で正確に測ら細胞濃度は、それぞれの菌株に対してほぼ同じになるように調整する必要があります。 </li><li>細胞は、細胞が運動性配偶子になるかを時間の間に、2時間に強い光（1.260μE / M 2 /秒 ）の下に攪拌されています。運動性は、光学顕微鏡下でチェックする必要があります。配偶子が悪い泳いでいる場合、交配は非効率である可能性が高いです。しかし、さらに悪い運動性株は、低い周波数をかん合します。 </li><li>次に、MT +とMT -配偶子の等しくないボリュームは、単一の50mlフラスコに結合されます。配偶子は、撹拌せずに強い光（1.260μE / M 2 /秒 ）の下に残されています。 </li><li>交配は、光学顕微鏡下ですぐに確認することができます。配偶子のペアが急速に形成され、急速に移動する細胞は鞭毛で接合として表示されます。交配は非常に急速であることが表示されている場合、サンプルは接合子の世代のために30分-1時間以内に撮影してください。そうでない場合、これは省略可能ですが、交配は、それぞれの時間を確認することができます。接合体の最適な密度を与える時間は、十字架の間に大きく変化するので、1時間、2時間、3時間及び4時間後に配偶子、などを組み合わせた後、異なる時間に交配の混合物のアリコートを取るのがベストです。プレート3〜4箇所、これは、300μLのサンプルに、TAP - 3％ディフコ寒天60 × 15mmのプレートを転送することによって行われます。これは交配のペアを混乱させる可能性があるため、交配の混合物を撹拌しないように注意してください。ディフコ寒天は、それが低価格の寒天よりも少ない汚染物質を持っているため使用され、そしてそれは、顕微鏡下で受精卵を見ることが容易になります。 未使用の交配混合物を一晩フラスコのままになってしまうこと、そして交配の反応の質は、翌日には明らかであろう。交配が効率的であるときは、接合体は、フラスコの壁や底に付着すると媒体が明確に表示されます。フラスコのさえ攪拌は、受精卵を取り除くために、失敗します。混合物を合理的な勢いで興奮しているガラスに何もスティックは、その後、交配は非効率的だったか行われなかった場合。 </li><li>どのような表面の液体が吸収されるまで交配の混合物を含むTAP - Difco社のプレートは、半開きにふたで、無菌フード内で乾燥されています。接合胞子の成熟だけ暗闇の中で行われるので、プレートは一般的に、その後、ホイルに包んで、18時間光（700 NE / M 2 /秒）に残されます。日付と時刻の交配、交配株は板と箔の両方で書かれています。接合子発芽効率が徐々に下落したものの、プレートは、5〜7日間保存されており、長く保持することができます。 </li></ol>パート3：TETRAD解剖<ol><li>栄養細胞は、メスのような退屈な刃を用いて交配混合物の乾燥スポットを、こすり落とすことがあります。ブレードは3％寒天にしっかりと付着される接合体の面積を、公開するために使用することができます。このステップは通常、受精卵は、次の朝までに発芽しているように、午後に行われますが、する2番目、植物分裂を受けていない8子孫を生む。 クラミドモナスの生物学者はすぐに彼らは栄養細胞よりも大きい、と黒い輪郭を与える厚い接合胞子壁を備えているため、顕微鏡下で受精卵を認識することを学ぶ。 Zygosporesは多くの場合黄色に見えますが、も少し緑があります。栄養細胞が容易に脇に移動している間、最も重要な文字は、彼らが寒天に固執するということです。プレートが過度に乾燥している場合は、このケースではないだろう。また、交配の混合物が非常に密である場合、受精卵は、個々の接合体の移動が困難または不可能になるマットを形成することがあります。適切な密度は、ステップ2.1で確立され、かつ迅速に経験して学習されます。 </li><li>ガラスの針は、受精卵を収集して四分子子孫を分離するために用意されています。これらは決裂することができる長い、細い糸を、生成するために小さな炎で3 mmのガラス棒を引いて準備されています。これらのテーパー端部の先端は、弱火で短時間加熱（例えばアルコールまたは燃焼マッチ）で、フックに平滑化したり曲げたりしている。彼らは非常に壊れやすいので、特に経験の浅いユーザーのために、、3つ以上のガラス針を準備します。 </li><li>受精卵は、小さな山にガラス針を用いて3パーセントTAP -ディフコプレートに収集されます。接合体を含む寒天の二乗（最大0.5 cm 2）を鈍いメスを用いて形成され、摘出される。その後、寒天ブロックを15mm 1.5パーセントTAP -ディフコプレートに顔を下に配置され、そして受精卵を配布するため、プレートの上部から1.5 cm程度の水平線に沿って摺動。上部の水平線、および水平方向の約1.5 cmおよび0.5センチメートル垂直間隔を持つグリッドをプレートの後ろにエッチングされています。グリッドは、四分子​​の子孫を（グリッドも解剖の日をエッチングすることができます）を分離するためのガイドとして、次の日に使用されます。最後に、個々の受精卵は、プレート当たり約20〜30接合体で、それぞれの垂直線と上部の水平線の交点に移動されています。わずか12程度が解剖され、すべての接合子が発芽しない、といくつかは破裂する前に二回分裂しますが、その余分な受精卵が必要である。 </li><li>配布後に誤って3％寒天プレートから転送された接合体、および栄養細胞は、クロロホルムの薄い（1-2 mm）の層を含むガラス皿上に30秒間反転板をさらすことによって殺される。プレートとクロロホルムとの間の距離は約5cmになります。あまりにも多くのクロロホルムが使用されている場合は距離が小さすぎるまたは大きすぎる場合、または、一つのリスクはどちらの接合子を殺す、または栄養細胞を殺すことではない。 zygosporesが選択性を確保するために、発芽のプレートで配布された後にクロロホルム処理を直ちに行う必要があります。 </li><li>発芽はほとんどの菌株については16〜20時間がかかりますが、遺伝子型とし、受精卵の年齢とともに変化します。発芽のために、プレートは、低光（239 NE / M 2 /秒）の下に置かれている、または媒体に照らして組織でプレートを覆うことにより、淡色表示されます。 </li><li>発芽受精卵は、それらの中の娘細胞と腫れたり、時々バースト細胞として顕微鏡下で識別することができます。接合胞子が破裂していない場合、発芽が発生した場合に、穏やかにガラス針で触れると、壁を破るだろう。娘細胞を穏やかに接合子下の格子点にドラッグされます。ガラス針の圧力によって寒天から放出液体培地を少量の細胞を捕捉し、針の後ろにこの&quot;水たまり&quot;をドラッグすることによってこれを行うのが最も簡単です。いずれかの受精卵ではなく二回分けている栄養細胞を解剖したことを&quot;保険&quot;の一形態では、離れてfour娘細胞から、接合胞子の壁の&quot;皮膚&quot;が残ることです。 </li><li>目に見えるcloniesが、その後の分析のために選択できるまで、解剖子孫は、適切な条件下で栽培されています。プレートは、汚染のために毎日監視する必要があります。 </li></ol>注：植物二倍体の世代はここでは扱いませんが、本質的にどちらかの親系統の増殖をサポートしませんが、二倍体の成長（例えば、二つの異なるauxotropicマーカー）をサポートする培地上で交配の混合物をめっき伴います。プレートは、接合体の形成を避けるために、光に保管されています。

<ol>
	<li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+Sourcebook:+Introduction+to+Chlamydomonas+and+Its+Laboratory+Use.">The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 119-273 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

遺伝学的解析は、 クラミドモナスにシンプルですが、それは特定のテクニックは配偶子と別々の四分子の子孫を生成する必要があります。健康な株で、技術は容易に取得されます。いくつかの変異株と、それは芸術のより多くなり、読者は歴史的なメモや実用的なヒントのための最近発行されたクラミドモナスのソースブック第1巻を参照する必要があります。さらに、それは?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CC-125</td>
<td>Mating type plus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC-124</td>
<td>Mating type minus strain</td>
<td>Chlamydomonas Stock Center</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-Acetate-Phosphate (TAP) </td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N10</td>
<td>Growth medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Stainless-Steel Blades</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-916-5B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Surgical Blade Handles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-914-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fisherbrand Metal Scalpels</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-920A</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mating and tetrad separation of chlamydomonas reinhardtii for genetic analysis

単細胞緑藻<em&gt;クラミドモナス</em&gt;（<em&gt;クラミドモナス</em&gt;）は、そのシンプルなライフサイクル、遺伝学的解析のための成長と操作の容易さ、ゲノムリソース、および核の変形との両方の細胞小器官の細胞生物学と遺伝学のさまざまな分野で研究のための普及した生物となっている。遺伝学的アプローチがで使用されている場合交配株は、一般的な方法です。<em&gt; Chlamydomonass</em&gt;、支配の分析のための栄養二倍体を作成、または把握の核対オルガネラ継承する四分子解剖を以下、対立性をテストするために、epistasyを分析するために、またはマップベースクローニングの目的のための集団を生成するために。さらに、遺伝的交雑は日常的に特定の核の遺伝子型とオルガネラ遺伝子を組み合わせるために使用されます。ここでは、配偶子形成、交尾、接合子発芽と四分子分離のための標準的な方法を示しています。このプロトコルでは、とあまり精通している科学者への遺伝的アプローチは、従順させる予定のステップのわかりやすいシリーズで構成されています<em&gt;クラミドモナス</em&gt;。主要なパラメータと問題点が説明されています。最後に、さらなる情報と代替法のためのリソースが用意されています。

Watch this Scientific Journal Video about Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis at JoVE.com

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

嵌合と四分子の分離は、遺伝子分析のために必要です。<em&gt;クラミドモナス</em&gt;。ここでは、配偶子形成、交尾、接合子発芽と四分子の解離の標準的な方法を示しています。このプロトコルでは、とあまり精通している科学者への遺伝的アプローチは、従順させる予定のステップのわかりやすいシリーズで構成されています<em&gt;クラミドモナス</em&gt;。

交配との四分子の分離クラミドモナス遺伝子解析用

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

mating-tetrad-separation-chlamydomonas-reinhardtii-for-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

19.8K ビュー.  Cornell University. 嵌合と四分子の分離は、遺伝子分析のために必要です。クラミドモナス。ここでは、配偶子形成、交尾、接合子発芽と四分子の解離の標準的な方法を示しています。このプロトコルでは、とあまり精通している科学者への遺伝的アプローチは、従順させる予定のステップのわかりやすいシリーズで構成されていますクラミドモナス?...

ビデオ: Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

マウス用ダーク/ライト遷移テスト

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

生物学

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

チックの全マウントの抗体染色のための方法

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

成体マウスから海馬歯状回の解剖

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...