この方法は、タンパク質をセントリオルの特定の領域に局所化するなど、セントリオイル分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。我々は複数の向きにそれらを得るために中心を集中する手段を提供するこの技術の主な利点。この方法はクラミドモナス中心菌生物学に関する洞察を提供することができるが、孤立したヒトおよびパラメシウム中心子のような他のシステムにも適用することができる。
この手順のデモンストレーションは、博士課程の学生ニコライ・クレナ、もう一人の博士課程の学生マエヴァ・ル・グエンネック、そして研究室Davide Gambarottoのポスドクです。この手順を開始するには、まず、テキスト プロトコルで説明されているように、すべてのメディアを準備し、C.Reinhardtii セルを培養します。調製した細胞を50ミリリットル円錐形チューブに移し、600倍gで10分間遠心分離します。
ペレットを50ミリリットルの1x PBSで1回洗い、600倍gで再び10分間回転させます。ピペットを使用して、ペレットを室温脱フラグバッファーの 100 ミリリットルに再懸濁させます。ビーカーを磁気スターラーに置き、0.5モル酢酸を4.5~4.7の最終pHにゆっくりと加えます。
この混合物を室温で2分間インキュベートしましょう。この後、pHを7.0に復元するために1つの通常の水酸化カリウムの滴をゆっくりと加え、50ミリリットルのチューブに細胞を移し、遠心分離機を600回gで10分間、剥離した旗毛を除去する。上清を捨て、ペレットを氷の上に保管して、水洗の準備が整うまで保管します。
準備ができたら、1回の洗浄で1x PBSの50ミリリットルを1回で2回洗浄します。洗浄したペレットを600g、摂氏4度で10分間回転させます。1x PBSの30ミリリットルでペレットを再懸濁します。
その後、25%スクロースの20ミリリットルのクッションにゆっくりと懸濁液を積み込みます。600倍gと摂氏4度で15分間回転し、残りのフラゲラを取り除き、ショ糖中の細胞を広げます。吸引器を使用して、慎重に最下20ミリリットルだけを保つ上清を吸引する。
残りのショ糖を20ミリリットルの冷たいPBSを加えて洗います。600倍gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。ペレットを摂氏4度で10ミリリットルのPBSで再懸濁し、溶液に塊がないことを確認します。
再懸濁されたペレットを新しい250ミリリットルのボトルに移し、5,000単位のDNaseを添加したリシスバッファーを細胞を含むボトルに加えます。1時間摂氏4度でインキュベートし、ボトルを慎重に反転させて15分ごとに混合します。50ミリリットルの円錐形チューブと遠心分離機に50ミリリットルの円錐チューブと4°Cで10分間移します。
ピペットを使用して、上清を収集し、60%スクロースクッションの2ミリリットルを含む氷の上に30ミリリットルの丸底チューブにロードします。摂氏4度で30分間、10,000倍gでこれを遠心分離します。この後、上清をスクロースクッションの上に1ミリリットルまで吸引する。
残りの上清の1ミリリットルとショ糖クッションの2ミリリットルの間の黄色の界面に注意してください。カットP1000チップを使用して、残りの上清とスクロースを軽く混ぜます。すべてのショ糖クッションをプールし、氷の上に保管してください。
次に、テキストプロトコルで概説されているように、薄壁の38.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに40%〜70%のショ糖勾配を調製する。プールされたインターフェイスをゆっくりとグラデーションに読み込みます。チューブと10ミリモルK-PIPESバッファーのバランスをとり、遠心分離機を68、320倍g、摂氏4度で75分間バランスを取ります。
この後、0.8ミリメートルの針を使用してチューブの底に穴を開け、異なるショ糖層を乱さないようにします。この穴を使用して摂氏4度で12 500マイクロリットル分を集めます。切り取ったP200先端を用いて、免疫蛍光の間に使用される各分画から追加の10マイクロリットルのアリコートを調製する。
その後、液体窒素中の分画をスナップ・フリーズします。まず、無菌の12ミリメートルのカバースリップをコンセントレータの凹んだ下端に置き、PDLコーティングされた側面を下に保つようにします。アダプターを上に直接置き、カバースリップをキャップします。
次に、丸底チューブを反転し、コンセントレータ、カバースリップ、およびアダプターの上に置きます。ピンセットを使用して、チューブの底に到達するまでアンサンブルを軽く押し、チューブを反転します。それがコンセントレータの上部に到達するまでK-PIPESバッファの10ミリモルを追加します。
コンセントレータの中央シリンダーに気泡がないことを確認します。濃縮されたセントオラー分画のアリコートの1つに10ミリモルK-PIPESバッファーの100マイクロリットルを静かに加え、P200ピペットを使用して完全に混合します。次に、濃縮器の中空の中心からK-PIPESバッファーの100マイクロリットルを取り除き、100マイクロリットルのバッファー分率混合物を加え、内容物がコンセントレータの中空の中心に残っていることを確認します。
摂氏4度に予冷された遠心分離機で10,000倍gで10分間回転します。この後、ピンセットを使用してコンセントレータを取り外します。アダプターのスロットエッジにある穴に手作りのフック装置を挿入し、カバースリップを回復するために穏やかに持ち上げます。
チューブの上部に到達したら、手袋をはめた指を使用してアダプタの端をトラップし、ピンセットを使用してカバースリップを取り外し、カバースリップのどの側にセントリオルが含まれているかを念頭に置きます。次いで、濃縮中心の固定および免疫蛍光染色を行う。まず、調製されたクリスタルポリスチレン透過ラボボックスに中心を含むカバースリップをマイナス20°Cで5分間インキュベートします。
ピンセットを使用して、カバーリップを50ミリリットルの1x PBSで満たされた透明な実験室用箱に移します。スライドをPBSで室温で5分間洗います。次いで、ピペット60マイクロリットルの一次抗体が加湿室で実験室のシーリングラップの一部に混入する。
慎重にドロップに直面している中心と抗体ミックスの上にカバースリップを置きます。カバーリップを45分間インキュベートします。この後、カバーリップを取り外し、PBSが入った箱の中で5分間洗います。
洗浄したカバーリップを45分間インキュベートし、PBS1%BSAおよび0.05%Tween-20で二次抗体を使用します。カバーリップを取り外し、PBSが入った箱の中で5分間洗います。通常のアンチフェージング取り付けメディアを使用して、カバースリップをスライドに取り付けます。
次に、デコンボリューションを適用しながら、N.A.の1.4の63X油目的で共焦点顕微鏡上の単離されたセントリオレスを画像化します。Zスタックの上と下の位置をそれぞれ中心信号の上下に設定し、総セントリオイル信号を構成する大きな画像スタックを取得します。スタックを投影し、テキスト プロトコルで説明されているように、単一パーティクルの平均化を実行します。
代表的な免疫蛍光は、6つの分画が単離された中心胞に富み、分数3のピークを有し、最後の2つの分数は、精製が成功したことを示すことを明らかにした。コンセントレーターなしでは1つの視野につき約30セントリオールしか見られず、183はコンセントレータで見られます。これは、コンセントレータステップが成功し、定義された領域で6倍のセントリオルの濃縮を可能にし、それらを検出して画像化することを容易にすることを示しています。
超解像顕微鏡は、モノグルタミルチル化チューブリンに染色されたセントリオレスを画像化するために使用され、ソフトウェアは、選択された各方向のほぼ完璧な平均を生成するために使用されます。5回の反復の後、2つのクラスの平均がモノグルタミル化された中心胞(63個の物体からのトップビューと98個の粒子からの側面図)で生成された。サイドビュークラス平均の長さは260ナノメートルで、直径は250ナノメートルで、中心のコア内に局地化することが見られる測定されたモノグルタミルレートチューブリン信号に匹敵する。
この手順を実行している間、孤立したセントリオルを氷の上に置いておき、隔離後にスナップフリーズすることを忘れないでください。この手順に従って、クライオ電子顕微鏡法および質量分析のような他の方法は、中心または中心タンパク質組成物の天然アーキテクチャのような追加の質問に答えるために行うことができる。
