Name: an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
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著者らは、変性表皮SIT（5の多施設国際検証研究に参加するためBfRは（ドイツ）、BASF SE（ドイツ）、IIVS社（米国）、ゼットイン- LSL（オーストリア）でZEBETに感謝したいと思います）。

I.ティッシュコンディショナー - 0日目<ol><li>表皮EPI - 200 - SITのキットを受け取ると、（キットの詳細については、特定の試薬と機器の表を参照）整合性のためにすべてのキットコンポーネントを確認してください。 </li><li> 、3表皮組織、ある滅菌6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mlをあらかじめ入力して準備する。 </li><li>無菌条件下で、表皮の組織を含む24ウェルプレートを含むビニール袋を開いて、滅菌ガーゼを取り除く。 </li><li>表皮の組織を含む各インサートを削除し、空の24ウェルプレートのインサートを配置するために滅菌ピンセットを使用してください。このステップの間、滅菌濾紙上にブロッティング穏やかでインサートの外側に付着している残りの出荷アガロースを削除します。 </li><li>次の5分以内に、視覚的に組織を検査する。完全に液体で覆われている欠陥のある組織や組織を使用しないでください。 </li><li>滅菌綿棒の綿棒を使用して、慎重に組織の表面を乾燥させる。直接組織に触れないようにしてみてください - 毛細管効果は、組織表面から水分を除去するのに十分です。 </li><li>組織表面を乾燥した後、6ウェルプレートアッセイ培地0.9 mLであらかじめ入力の一番上の行に3つの組織を移す。インサートの下に閉じ込められた気泡を離します。 </li><li> 60用インキュベータへの挿入を含む6ウェルプレートを置き± 37℃で5分間プレインキュベーション± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH（相対湿度）。 </li><li> 60 ± 5分間プレインキュベーション期間の終了時に、6ウェルプレートの下側​​のウェルに上限井戸から挿入して転送する。バック一晩プレインキュベーション（18 ± 3時間）のためのインキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）にプレートを置きます。 </li><li>冷蔵庫（5 ± 3℃）にアッセイ培地の残りを置きます。プレインキュベーション一晩続いて、被験物質は、表皮の組織に適用することができます。 注：プレインキュベーションの手順は、後半に組織の配信の場合（組織が ​​水曜日の代わりに火曜日に到着する場合など）に短縮することができます。 </li></ol> II。化学物質の曝露 - 1日目<ol><li>わずか0.9 mlあたりウェルのアッセイ培地で上段を充填することにより被験物質ごとに、6ウェルプレートを準備します。 </li><li>約5分の化学物質への計画的な露出の前に、インキュベーターからプリエアコン組織を含む6ウェルプレートを取り外します。 </li><li>組織の面を評価し、滅菌綿のヒントを使用して水分を取り除く。 </li><li>試験物質のコードや名前を持つすべての6ウェルプレートの蓋にラベルを付けます。 </li><li>投与量1分間隔で被験物質を有する組織は、曝露後の被験物質の洗浄容易にする。最後の組織が投与されるまで、無菌フード内投与された組織でプレートを保管してください。 </li><li>液体化学薬品をテストするには、直接組織の上に溶液30μLを分注し、組織の表面にナイロンメッシュを配置。必要に応じて、そっとガラスパスツールピペットを率いる電球を使用してメッシュを配置します。組織表面に押さないでください。 </li><li>半固体をテストするため、直接組織の上に30μLを分注するために容積式ピペットを使用してください。パスツールピペットを持つ化学物質は、可能な限り組織の表面をカバーするために必要なスプレッド場合。 </li><li>固体材料の場合は、すぐに被験物質の適用前に、滅菌DPBSの25μLを組織表面を湿ら。これは、被験物質による組織表面の接触が改善されます。細かく粉砕された試料の約25 mgの25 mgのキャリブレーション鋭いアプリケーションのスプーン（または他の適切なツールを）埋める。組織表面に固体の被験物質を適用します。必要に応じて、完全にスプーンを空にするパスツールピペットを率いる電球を使用してください。ゆっくりと表面に固体の拡散を改善するために挿入を振る。 </li><li>ろう状の粘度を持つ被験物質の場合は、直径で約8mm作品フラット&quot;のようなクッキー&quot;を形成し、以前に滅菌DPBSで濡らしていた組織、頂上に配置してみてください。被験物質と組織との間の接触を改善するために、ステンレス製またはプラスチック製の助けを借りて、&quot;クッキー&quot;を下に重量を量る。 </li><li>陰性コントロールとコントロールの組織に陽性対照として5％SDSなどのDPBSを適用します。 </li><li>最後のティッシュを投与した後、加湿インキュベーター（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）。ために35のすべてのプレート± 1分を転送</li><li> 35後の± 37℃で1分間のインキュベーション℃のインキュベータからのすべてのプレートを取り外す。無菌フードにプレートを置き、60分の化学物質暴露の期間が最初に投与された組織のために完了するまで待ちます。 </li><li>その後（insurする分の時間間隔ごとにインサートを使用して洗浄操作を開始すべての挿入のための総露光時間が60分であることを電子）。 </li><li>滅菌DPBSで組織を洗浄する洗浄瓶を使用してください。 DPBSの定数ストリームを使用して15回インサート組織を記入し、（注、それを空にする：。ナイロンメッシュを有する組織のために、組織の表面を5回洗浄し、先の尖った、鋭いピンセットで慎重にメッシュを削除するには、その後、残りを続行10回洗浄）。 </li><li> 15日以降に150mlのDPBSで完全に水没挿入3回、洗浄瓶を用いて洗い、試験材料の残りの部分を削除するには振る。 </li><li>最後に、滅菌DPBSで一回内側からと一度外から組織のインサートをすすぐ。 </li><li>優しくインサートを振って、滅菌吸い取り紙の上にブロッティングにより組織からDPBSの余分を削除します。 </li><li>以前にアッセイ培地であらかじめ入力された新しい6ウェルプレートにブロット組織のインサートを移す。これらの手順はすべて、（14-18）、挿入のたびに1分以内に行う必要があります。 </li><li>最後の組織をリンスした後に、慎重に滅菌綿棒をチップソーで各組織の表面を乾燥させる。 </li><li>次の24 ± 2時間（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）のためにインキュベーターで組織をインキュベートする。 注：各アッセイの技術者は、下記のようにプロトコルに従うことができるように、単一のテストラン（セット）での陰性および陽性対照を含めて7つ以上の試験物質をテストしてはいけません </li></ol> III。培地の交換 - 2日目<ol><li> 24 ± 2時間後のインキュベーションの後、6ウェルプレート、メディア0.9 mlを事前に満たされたの下部に挿入して転送する。上段からのメディアは、追加のエンドポイント（サイトカイン、ケモカインなど）の分析用に収集することができます。二次エンドポイントの解析は任意です。 </li><li>ポストインキュベーションを続行します（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）さらに18 ± 3時間。 </li></ol> IV。 MTT生存率アッセイ - 3日目<ol><li>ラベル化学物質名またはコードを持つ2つの24ウェルプレート。一つのプレートには、MTTと抽出工程のための他に組織のインキュベーションのために配信されます。 </li><li> MTT濃縮物（5 mg / mL）を解凍し、MTTの希釈剤で希釈してMTT溶液を調製します。 MTT溶液の最終濃度は1 mg / mlである。 </li><li>ピペット24ウェルプレートの各ウェルにMTT溶液を300μL。 </li><li>インキュベーターから6ウェルプレートを取り外す、吸い取り紙でインサートの底面を覆い隠す、そしてMTT付きプレフィルド24ウェルプレートにそれらを転送する。 </li><li>インキュベーター内で24ウェルプレートを配置する（37 ± 1℃、5 ± 1％CO 2、95％RH）と3時間インキュベート± 5分。厳密に3時間を厳守±異なるMTTの測定値との偏差を避けるために5分のインキュベーション時間を。 </li><li> MTTのインキュベーションが完了すると、静かに全ウェルのMTT培地を吸引する吸引ポンプを使用してください。 </li><li>リフィルは、DPBSで井戸と再び吸引。この洗浄をさらに2回繰り返し、組織の最後の吸引後乾燥していることを確認してください。 </li><li>洗浄後、新しい24ウェルプレートにインサートを移す。軽く各インサートに2 mLの抽出液（イソプロパノール）をピペッティングすることによって、挿入を浸し。レベルは、このように完全に組織を水没、インサートの上端よりも高くなります。 </li><li>抽出剤の蒸発を抑制するために24ウェルプレートを（パラフィルムやシール袋を使用する場合の例）封印。プレートシェーカー（約120回転）で静かに撹拌しながら室温で少なくとも2時間のために組織からMTTを抽出する。振盪せずに一晩抽出を使用することもできます。 </li><li>抽出期間が完了したら、ピアス注射針や電球パスツールピペットをビーズと抽出液が、挿入が取得されたウェルに実行できるようにすると挿入。 </li><li>パンクしたインサートを破棄し、それが均一になるまで上下に三回ものソリューションをピペット。 </li><li>それぞれの組織の場合は、96ウェル平底マイクロタイタープレートに紫色のホルマザンのソリューションの2つの200μLのアリコートを移す。このビデオプロトコルに付随するスプレッドシートで指定された固定プレートのデザインに応じて複製を転送する。ブランクの場合は、イソプロパノールを使用してください。 </li><li>基準フィルタなしで570 nmの（540〜580）の波長を用いて96ウェルプレート分光光度計でMTTの抽出物の光学密度（OD）をお読みください。 </li><li>結果の自動計算（図1）のためのスプレッドシートに結果を入力してください。 </li><li> MTTアッセイによって決定されたパーセントの組織の生存率は陰性対照に対する相対的な&lt;50％の場合、試験物質は&quot;刺激&quot;（R38またはGHSカテゴリ2）ラベルが付いています。 注：MTTは有毒なので、取り扱う際には必ず手袋を着用してください。 MTTとそのように保護する軽いから、MTTからlutionsは敏感な光です。それは時間の経過とともに低下するので、調製後数時間以内にMTT溶液を使用してください。 </li></ol> V.アッセイの品質コントロール<ul><li>表皮EPI - 200 - SITキット承認基準： 体外 RHEモデルではなく、検証のプロセス（8）中、時間をかけて一貫性のある、高品質なデータを提供する必要があります。長期的なアッセイの再現性とパフォーマンスを確保するために推奨されるガイドラインは、&quot;パフォーマンスのための各ロットのサンプリングを細胞または組織の完全な特性、...、及びアッセイのパフォーマンスの一貫性の保証を提供するコントロールとベンチマーク化学物質の定期的な使用&quot;（9）が含まれ。以下に概説するアッセイの受け入れ基準に加えて、表皮の各製造ロットは、追加のベンチマークの化学物質（1％トリトンX - 100）に対して製造業者によってテストされた品質管理です。トリトンX - 100の50％（ET - 50）に組織の実行可能性を減らすために必要な露光時間が決定されます。表皮の場合は、年平均ET - 50値は5.9時間から7.5時間であったしている。ネガティブコントロール組織のための多くのCV（ベースラインの生存率の変動性をすなわち）の多くは、1996年から毎年7.5％の下に平均しています。順番に各製造ロットのET50値は、（上限許容限界= 8.7h;下限許容限界= 4.8h、すなわちET - 50 = 6.7時間）、1996年に設立された歴史的な平均的なトリトンX - 100 ET50の2標準偏差内に収まっている必要がありますメーカーによる使用のためにリリースされる。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準1：ネガティブコントロール： MTT試験でネガティブコントロール（NC）組織の絶対的なODは（滅菌DPBSで処理）の手順を出荷し、保管した後や特定の使用条件下での試験所で得られた組織の生存能力の指標です。 NC組織の平均OD 570は ≥1.0と≤2.5の場合アッセイは、受け入れ基準を満たしています。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準2：ポジティブコントロール 5％SDS（H 2 O中）ソリューションは、ポジティブコントロール（PC）として使用し、被験物質と同時にテストされています。 PCは、それぞれのアッセイで試験することではなく、複数のPCが一日のテストごとに必要とされていることを同時手段。陽性対照の生存率は、過去のデータの95％信頼区間内にある必要があります。ネガティブコントロール組織の％として表されるPCの組織の平均生存率が20％の場合、アッセイは、受け入れ基準を満たしています。 </li><li> EPI - 200 - SITアッセイ受け入れ基準3：標準偏差（SD） 皮膚刺激性は、3つの組織で決定されるため、組織の変動が許容可能な低いはず複製、平均生存率から予測される。同じ3個％の組織の生存率から算出したSDが複製処理された場合アッセイは、受け入れ基準を満たしている&lt;18％である。 </li></ul>代表的な結果<div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="図1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="図2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="図3" /> </div> 図1 6のテスト記事、NCとPC制御のために得られた結果- 結果の計算のための自動化されたスプレッドシートの一部。 NCを基準にして50％未満の組織の生存率を減少被験物質は刺激性として分類されます。テストは、このように検定の頑健性を高める分類カットオフ（50％生存率）から十分に離れている結果を提供するために最適化されています。 <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> 材料 </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="材料リスト" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発し、化粧品及び医薬品成分を含む化学物質のin vitroでの皮膚刺激性試験のための検証を実証した。プロトコルからの逸脱が異なる結果を引き起こす場合があるので、このメソッドを実行するとき、それは、無菌条件下で動作するようにし、厳密に検証プロトコルに従うことが重要です。アッセイのいくつかの変形が可能である、しかし、プロトコルへの変更は、著者と直接相談する必要があります。 この方法の唯一の制限は、MTTのエンドポイントとの被験物質の干渉の可能性があります。直接MTTを減少させる色の被験物質または1つの（そしてそれによって細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性を模倣するには）MTTエンドポイントを妨げる可能性があります。しかし、これらの被験物質は、まだ（またはで）で組織を提示している唯一のMTT試験（すなわち42時間被験物質の暴露後の）被験物質の十分な量の時の場合の問題です。この万一の場合には、着色された試験物質や試験材料による（false）を直接MTTの還元により（本当の）代謝MTTの還元と貢献はで提供されるアッセイの標準操作手順で詳しく説明されている手順によって定量化することができるマテック株式会社

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）を開発した<sup&gt;（1,2,3）</sup&gt;と検証<sup&gt;（4,5）</sup&gt;のための<em&gt; in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の&gt;皮膚刺激性試験、。表皮のSITは、3Dを利用<em&gt; in vitroで</em&gt;再構築されたヒト上皮（RHE）モデルの表皮。このプロトコルで説明する手順では、GHSのカテゴリー2及び非刺激性物質の刺激性物質の区別を可能に<sup&gt;（6）</sup&gt;。試験はプレインキュベーション、60分露出、42時間のポストインキュベーションとMTT生存率アッセイから成る、4日間の期間の経過とともに行われます。組織の領収書と一晩プレインキュベーション（0日）した後、組織を局所的に液体、半固体、固体またはワックスすることができるテストの化学薬品（1日目）、にさらされている。三つの組織は、各被験物質のためだけでなく、ポジティブコントロール（5％水溶液。SDS溶液）、及びネガティブコントロール（DPBS）に使用されます。化学物質の曝露は、組織を37℃インキュベーター内に保持され、そのうち35分℃、60分間持続する被験物質は、広範な洗浄の手順で組織表面から削除されます。組織のインサートは、ブロットし、新鮮な培地に転送されます。 24時間の潜伏期間（2日目）後、培地を交換されます。培地は、サイトカインや関心のある他のエンドポイントのさらなる分析のために保存することができます。培地交換した後、組織を、さらに18時間インキュベートする。全体42hのポストインキュベーション（3日目）の終わりには、組織は、黄色のMTT溶液中に転送され、3時間インキュベートした。ミトコンドリア代謝を中心に形成された結果の青紫色のホルマザンの塩は、、イソプロパノールを使用して2時間抽出されます。抽出されたホルマザンの吸光度を分光光度計を用いて決定されます。化学物質は、陰性対照処置組織への相対的な組織の生存率が50％以下に下がっている場合刺激性として分類される。この手順は、EUの規制に沿って化学物質の危険有害性の特定とラベリングのためのin vivoでのウサギの皮膚刺激性試験での完全な代替として使用することができます<sup&gt;（7）</sup&gt;。

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An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）のために開発および検証を実証する<em&gt; in vitroで</em化粧品と医薬品成分を含む化学物質の&gt;皮膚刺激性試験、。

アンインビトロ</em表皮を使用して>皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

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Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

生物工学

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

皮膚修復を正確に評価するヒトEx vivo創傷モデルと全山染色法

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

発生生物学

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>効率的な3Dスキンモデルによる柔軟な研究アプリケーション

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:費用対効果の高い3D細胞モデルによるスキンモデルの多様性の強化

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

アンインビトロ皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

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三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

2Dと3Dの肌の改善

皮膚修復を正確に評価するヒトEx vivo創傷モデルと全山染色法

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築