このプロトコルは、安価で堅牢なオープンソースの機器であるsmfBoxを使用して生体分子内の正確な絶対距離を測定するために、誰もが単一分子FRET実験を行うことを可能にします。smFRET を使用すると、1 つの分子を平均数十億個の分子ではなく、一度に 1 つずつ見ることができるため、それらが採用するさまざまな立体構造を特徴付けることができます。この方法の美しさは、多くの生体分子系の構造とダイナミクスに光を当てるために使用できることです。
例えば、タンパク質フォールディング、タンパク質DNA相互作用、およびDNAアロステリが挙げられる。分析を開始する前に、レーザーコントロールセンターを起動し、連続波交流定電流モードが選択されていることを確認します。両方のレーザーの電源を入れ
smOTTER取得ソフトウェアを起動し、各計測器が正しく設定されていることを確認します。放出経路を揃えるには、目的に浸漬油を一滴置き、清浄なカバーガラスを対物レンズに慎重に置き、油に対して角度をつけて、カバーガラスと目的の間の気泡をトラップするのを防ぎます。次に、カバーガラスの中央に100ナノモルCy3B染料10マイクロリットルを加えます。
レーザーデューティサイクルパネルで、ドナーレーザーをゼロオフ、45オン、55オフに設定します。アクセクターレーザーを50オフ、45オン、5オフに設定します。レーザー励起またはALEXの交互の周期を100マイクロ秒に設定します。
Z フォーカスタブを開きます。取得パネルで、レーザーを切り替えてカメラを起動します。明るいスポットが黒い背景に囲まれて中央に表示されるように露出を調整します。
低い Z 位置から始めて、明るいスポットが最小サイズになるまで高さを増やします。その後、高さを 20 マイクロメートルまで上げ、レーザーをサンプルに油とカバーガラスの上に合わせます。サンプルがフォーカスを得たら、カメラを停止します。
omicronコントロールセンターでは、両方の検出器からの読み出しが観察されるまで、smOTTERの位置合わせタブでy軸スケールを監視しながら緑色のレーザーパワーを下げ、必要に応じてスケールを変更します。次に、smfBox の前面にある 4 本のネジを外して、前面パネルを取り外します。ピンホールを揃えるには、ピンホールポジショナーのXノブを回しながら、アライメントタブの信号を見ながら緑色と赤の信号を増やします。
Yノブを回してピンホールを他の方向に合わせ、Xノブに戻って信号のさらなる増加を確認します。ピンホールレンズを合わせるには、レンズXノブを一方向に回して信号を減らしてから、ピンホールXノブを同じ方向に回して信号を元のレベルに戻します。新しい最大信号が以前より高い場合は、ピンホールとレンズノブの両方をその方向に繰り回し、動かします。
信号が以前よりも低い場合は、ノブを反対方向に繰り返し動かし、ピンホールとレンズYノブを使用してアライメントを繰り返します。アバランシェフォトダイオードレンズの位置合わせについては、緑色のアバランシェフォトダイオードから始めて、緑色の信号が最大になるまでXノブを動かします。Yノブの信号変更を繰り返します。
Xノブに戻り、前後に移動して信号が落下し始めるしきい値ポイントを見つけます。信号は、この 2 つのポイントの中間の位置に置いたままにします。Yノブの中間位置を見つけ、赤い雪崩フォトダイオードのアライメントを繰り返します。
最初のサンプルを分析する前に、メタノール浸したレンズ洗浄組織でステージを洗浄し、一方の端から他方の端にそっと拭き取り、3~4滴の浸漬油を目的の中心に塗布します。1種類の超純水10マイクロリットルをクリーンカバーガラスの中央に加え、水の痕跡を監視して、蛍光信号が観測されないか確認します。その後、ゴムエンドのピンセットを使用してカバーガラスを慎重に取り外し、必要に応じて浸漬油を補充します。
1分子データが得られるように、サンプルを希釈した後、1秒当たり1〜5回のバーストが観察される濃度をライブトレースパネルで選択します。適切な濃度が決定されたら、直径8~9ミリメートルのシリコーンアイソレータを新しいカバーガラスの中央に押し込み、10マイクロリットルのサンプルを慎重に中央に加え、シリコーンとの接触を避けます。シールが形成されるまで、2番目のカバーガラスをアイソレータの上にしっかりと置きます。
ライブストイヒオメトリーとFRET効率ヒストグラムを調べて、サンプルが期待どおりに動作しているかどうかを確認します。保存設定パネルで、サンプル名と詳細、ドナーおよびアクセクサラベル、バッファー、ドナーおよびアクセクサ励起波長、検出波長およびレーザーパワー、エンドユーザーおよびユーザー所属の情報を入力します。取得パネルで、実験の長さを分単位で入力し、適切な保存間隔を選択して、エラーが発生した場合のデータ損失を軽減します。
必要に応じて[レーザーパワーを保存]を選択し、[開始]をクリックしてデータの取得を開始します。肯定的な結果では、1 秒あたり 5 ~ 1 回のバーストが得られます。否定的な結果では、あまりにも多くのまたは少なすぎるバーストが同じ時間枠内に観察されます。
コレクションと分析の後、交互プロットは実験的なセットアップのALEX期間と一致する必要があります。時間のトレースは、サンプル濃度が妥当であることを定性的に評価するために使用されます。背景プロットは、背景レートを推定するために長い時間に線形フィットを持つフォトン間遅延期間の分布を示しています。
バックグラウンド トレースを使用して、実験の実行中にサンプルに変更があったかどうかを識別できます。ストイキオメトリー対FRET効率ヒストグラムが生成され、すべての種と二重標識種を選択します。1D FRET効率ヒストグラムは、データのガウスフィッティングで生成されます。
したがって、ここでのサンプルの濃度が重要です。高すぎると、単一分子実験を行うことはなくなりましたが、低すぎるとデータを取得するのに時間がかかりすぎます。これは、NMRや結晶学のような他の方法では決定できなかった動的生体分子の構造の決定を可能にしました。
