Whole Mount Preparation and Confocal Imaging of the Murine Ocular Lens Anterior Region for Structural, Developmental, and Functional Insights

アガロースに固定化ディボットを作成することから手順を開始します。これを行うには、溶液が液化するまで、マイクロ波を使用してPBS中の2%アガロースを加熱および混合します。液化したアガロース250マイクロリットルをガラス底の皿にピペットで移します。

そして、柔軟なプラスチックカバースリップを使用して、皿を横切ってアガロースを平らにします。アガロースが冷えて完全に固まったら、先端の細い鉗子を使用してカバースリップを取り外します。次に、3ミリの生検パンチを使用して、皿の中央にあるアガロースに穴を開けます。

デリケートなタスクワイプの助けを借りて、余分なアガロースを取り除きます。PBSで水和させたアガロース型は、使用するまで摂氏4度で保管してください。単離ミラー眼レンズを取り付ける前に、レンズの種類に応じて、準備したアガロース型に2ミリリットルの適切な培地を追加します。

胚鉗子を使用して、固定レンズまたはライブレンズをアガロースのくぼみに静かに移します。次に、ディッシュを倒立顕微鏡ステージに置きます。核染色を視覚化して、前部が対物レンズに面した状態で水晶体が位置していることを確認します。

核が観察されない場合は、湾曲した鉗子を使用してレンズを約180度静かに回転させ、前方領域が対物レンズに面するようにします。次に、共焦点顕微鏡による画像取得に進みます。レンズカプセルの可視化では、40倍の対物レンズを使用し、ステップサイズ0.3ミクロンのZスタック画像を取得します。

WGA染色で示される水晶体嚢の表面前の最初の画像と、上皮細胞の頂端表面の後の最後の画像を取得します。上皮細胞を可視化するには、ステップサイズ0.3ミクロンの63倍対物レンズを使用してZスタック画像を取得します。