落花生の種子の孵化後、Aspergillus flavus胞子接種に続いて、鉗子を使用して寒天から種子片を取り除きます。13個のジルコニウムセラミックビーズが入ったラベル付きの7ミリリットルビーズバイアルにシードピースを入れます。フィトアレキシンとアフラトキシンの抽出には、種子のサイズに応じて、ビーズバイアルに2ミリリットルまたは4ミリリットルのメタノール水混合物を加え、毎秒5.5メートルで45秒間粉砕します。
次に、1,860 x gで3分間遠心分離し、上清を新鮮なバイアルに集めます。アフラトキシン分析では、ガラス棒を使用して90度の角度で切断し、ポリエチレン多孔質フリットを1.5ミリリットルのポリプロピレンカラムに挿入します。カスタムメイドのスコップで、50ミリグラムのマグネシウムシリカゲルをカラムに加えます。
同じフリットでカラムをキャップし、ガラス棒で押し下げます。0.5ミリリットルの上清をカスタムパックされたミニカラムに加え、抽出物が重力によって4ミリリットルのガラスバイアルに排出されるようにします。1ミリリットルのメタノール水混合物をカラムに加え、重力によって不純物を同じバイアルに洗い流します。
混合溶出液をバイアルから廃棄した後、1.2ミリリットルのアセトンアセチルニトリル水、88%ギ酸混合物をカラムに加え、アフラトキシン画分をきれいなガラスバイアルに溶出します。バイアルから溶媒を45°Cの加熱ブロック内の窒素の流れで蒸発させます。蒸発後、バイアルに蓋をし、砕いたサイコロで1分間冷却します。
カスタムメイドのパスツールピペットフィルターを使い捨ての試験管に入れ、氷の上に置いて、ろ過時の蒸発を最小限に抑えます。乾燥残留物を0.25〜1.0ミリリットルのメタノール水混合物に正確に溶解します。ボルテックス後、0.2ミリリットルのアリコートをフィルターに移します。
窒素ガスを使用して、400マイクロリットルのオートサンプラーバイアルへのろ過を迅速化します。バイアルをUPLCオートサンプラーに入れ、注入量を0.1〜3.0マイクロリットルに設定します。フィトアレキシンの場合は、7ミリリットルの遠心分離バイアルから200マイクロリットルの上清をパスツールピペットフィルターに移します。
ろ過後、ポリテトラフルオロエチレンセプタムと適合するキャップをバイアルに置きます。アフラトキシンの分離には、水、メタノール、および特定の割合の組成とランタイムを持つアセチルニトリルを使用してグラジエントを実施します。流量を 0.45 ミリリットル/分、実行時間を 9.5 分に設定します。
システムカラムヒーターで、カラム温度を摂氏40度に設定します。アフラトキシンを定量するには、励起波長と発光波長をそれぞれ362ナノメートルと440ナノメートルに設定します。次に、検量線法とUPCLソフトウェアマニュアルを使用して分析を行い、試験サンプル中のアフラトキシン濃度を決定します。
スチルベノイドの分離には、水、メタノール、および 88% ギ酸からなるグラジエントを使用し、特定の割合の条件と時間を使用します。流量を0.5ミリリットル/分、ランタイムを12分に設定します。検量線法を使用して、スチルベノイドの濃度を決定し、試験サンプルのピーク面積を純粋な真正標準と比較します。
UPLCベースのアフラトキシン定量法は、1回の注入で2ピコグラムの制限でアフラトキシンB1の高感度定量を実現します。野生のアレカ種から採取した種子の精製抽出物は、アフラトキシンの明確な定量を示しました。マグネシウムシリカゲルカラムアプローチは、アフラトキシン画分から不純物を効果的に除去し、以前の方法とは対照的に高い定量効率を示します。
さらに、この方法はピーナッツフィトアレキシンの定量にも役立ちます。
