コエンザイムAは、略してCoAと呼ばれ、細胞代謝の重要な補因子です。定量的測定は、動物モデルの栄養状態とホルモン状態で起こる変化を明らかにします。この方法は、CoA誘導体およびフリーCoAを含むセルラーCoAの総量を、簡単で信頼性の高い方法で定量化します。
脳鉄蓄積を伴う神経変性のいくつかのタイプは、CoA生合成経路の遺伝子の突然変異に関連している。すべての生物は生存、成長、および機能のためにCoAを必要とするので、この方法は、任意の生物学的システムに適用することができます。初めての研究者は、サンプルを絶対に冷たく保ち、すぐに水酸化カリウムに移す必要があるサンプル調製の最初のステップに苦労するかもしれません。
水酸化カリウムに移す前にバッチ内のサンプル数を制限し、実験サンプルを操作する前に転送を練習します。多くの研究者は、後の生化学的分析のための生物学的サンプルの調製において固相抽出に精通していない。まず、培養皿を並行してインキュベートし、生化学的分析用に2つ、生存可能な細胞数を決定するための1つをインキュベートする。
培養が後期サブコンフルエント密度に近づくと、例えば、ヒトHepG2/C3A細胞は6〜8倍の密度に成長し、6個またはHEK 293T細胞が100ミリメートル皿当たり約1.3倍の密度に成長し、培養中の接着細胞を収穫する。その後、同じ培養皿に氷冷水を1ミリリットル加えます。皿の中の冷たい水に細胞を削り、400マイクロリットルの0.25モル水酸化カリウムと1.5ミリリットルの水を含むガラス試験管に細胞懸濁液を移し、pHを12以上に持ち込みます。
サスペンションを高く10秒間ボルテックスして激しく混ぜます。その後、パラフィンフィルムでしっかりと覆い、水浴で振ることなく1時間摂氏55度でインキュベートします。次に、1モルトリズマ塩酸塩溶液160マイクロリットルと100ミリモルmBBrの10マイクロリットルを加えます。
高い渦を10秒間混ぜます。これにより、pHは約8にして、フリーCoAでmBBr反応をサポートします。チューブをパラフィンフィルムで覆い、MBBrがCoAのチオールと反応するように暗闇の中で室温で2時間インキュベートします。
2時間後、100マイクロリットルの酢酸を加え、10秒間ボルテックスで混ぜて反応を止めます。沈殿はチューブに形成されます。次に、2,000回gで遠心分離機を15分間用いた。
沈殿した細胞の破片を除去するには、固体相抽出カラムのクリーンアップのためにガラス試験管に上清を移して保存する。分析を開始する前に、ローター・ステータ・ホモジナイザーによるプローブの挿入と組織破壊用に設計されたガラス試験管に、水酸化1ミリモルの2ミリリットルを加えます。チューブは使用するまで氷の上に置いてください。
凍結した組織片を素早く秤量し、サンプルごとに湿った重量を記録します。ガラス管に組織を移し、30秒間組織を均質化する。組織の完全な解凍を避けてください。
0.25モルの水酸化カリウムを500マイクロリットル加えます。10秒間高い渦を、氷の上に保ちます。これにより、12以上のサンプルのpHを加水分解してCoAチオエステルを加水分解し、合計CoAを生成します。
パラフィンフィルムでチューブを覆います。培養細胞の調製および組織の調製は、この手順の中で最も重要なステップである。CoAの分解を防ぐために、高水酸化カリウムを迅速に添加することが重要です。
加水分解を支持するために振ることなく、水浴で2時間摂氏55度でサンプルをインキュベートします。次に、1モルのトリズマ塩酸塩150マイクロリットルと100ミリモルmBBrの10マイクロリットルを加え、無料CoAでmBBr反応を支持するためにpHを約8に持ち込む。10秒間高い渦。
チューブをパラフィンフィルムで覆い、暗い状態で室温で2時間インキュベートし、すべてのCoAがmBBrで誘導体化されるようにします。その後、100マイクロリットルの酢酸を加え、渦を10秒間高く加えて反応を止めます。遠心分離機を15分間15分間gの2,000回でペレットにし、上澄み物をガラス試験管に移して固相抽出カラムをクリーンアップする。
室温では、1ミリリットルの使い捨て2-2-ピリジルエチルシリカゲルカラムを1ミリリットルの洗浄バッファーで平衡化し、ピリジル官能基がプロトン化され、アニオン交換体として機能することを確認します。次いで、試料上清をカラムにピペットし、溶出物を回収する。カラムを1ミリリットルの洗浄バッファーで2回、1ミリリットルの水で1回洗浄して、未留保種を除去します。
次に、別のガラス試験管に、CoA-bimaneを回収するために1ミリリットルの溶出バッファーでカラムを2回洗浄する。窒素ガスの下でチューブ内のCoA-ビマネサンプルを乾燥させます。シールは、完全にチューブをカバーし、マイナス20度で保存します。
HPLC分析の準備ができたら、300マイクロリットルの水でサンプルを再懸濁し、高い渦を10秒間ボルテックスして激しく混ぜます。再懸濁したサンプルを遠心分離管フィルターに移し、遠心分離機を5,000回gで10分間移動して沈殿物を除去します。次いで、ろ過したサンプルを、HPLC注入に適したガラスバイアルに移す。
本研究では、代表的なHPLCプロファイルは、C18 HPLCカラム上のCoA-バイマネ標準の保持時間を示す。CoA-ビマネ標準の増加量を個別に注入し、CoA-ビマネクロマトグラムのピーク下の領域を入力CoA-bimaneの関数としてプロットした。標準曲線は、393ナノメートルの波長でCoA-ビマネの吸光度の大きさを反射した。
CoA-bimaneの蛍光は、393ナノメートルの励起波長と470ナノメートルの発光波長でも反射した。マウス肝臓またはヒト培養C3A細胞の後のHPLC分離および典型的な検出プロファイルは、ここでは、溶出プログラムを使用して11〜12分間の保持時間を有する赤色のピークによって示される。mBBrとの反応が検出可能な結果を得られない場合、Trizma-HClの量はpHを約8に下げるために調整する必要がある。
それは、バイマネ誘導体としてスルヒドリルまたはチオエステル部分を含む追加の細胞分子を検出することが可能です。例えば、グルタチオンビマネは、HPLC法で検出することができる。この技術は、他の研究者が2型糖尿病の動物モデルなどの代謝不均衡に関連するCoA機能不全の潜在的な役割を調査することを可能にする。
研究者は、固相抽出に使用される有機溶媒を扱う際に、個人用保護具を使用する必要があります。
