サルモネラ菌培養物を細菌ファージに感染させるには、サルモネラ菌の一晩培養液を最終容量の5ミリリットルのLBで希釈し、それに0.1ミリリットルの以前に調製した細菌ファージ溶解物を添加します。その後、摂氏37度、200RPMで24時間インキュベートします。50ミリリットルの円錐形遠心チューブで、ファージを含む細菌培養物を0.22ミクロンのLB5ミリリットルで100倍に希釈します。懸濁液を2, 377gで10分間遠心分離する。
上清を慎重にデカントし、細胞の存在を確保するために底にいくらかの量を残します。0.22ミクロンのLB培地10ミリリットルで細菌細胞を洗浄します。遠心分離と洗浄を3回繰り返した後、ろ過したLBの5ミリリットルにペレットを再懸濁します。得られた細菌懸濁液の50マイクロリットルを滅菌0.45ミクロンフィルターでろ過するために、真空ろ過システムを採用します。
ろ過した100ミリリットルのろ過 LB.To フィルターをすすぎ、細菌細胞からのファージ放出を促進し、システムを分解せずに細胞を含むフィルターをインキュベートします。前に示したように、真空ろ過システムを使用してフィルターを再度すすぎます。滅菌鉗子を使用してフィルターから細菌細胞を回収するには、フィルターをフラスコに移します。
次に、2ミリリットルの2x LBをフィルターとピペットで数回追加して、細胞をフィルターから放出します。この懸濁液の1ミリリットルを10, 354gで2分間遠心分離する。上清を捨てた後、ろ過したLB培地1ミリリットルで細胞を3回洗浄します。
次に、細胞を2x LBの1ミリリットルに再懸濁します。次に、市販のサルモネラ・エンテリカ・リポ多糖類(LPS)を、ろ過されたLB1ミリリットルに20マイクロリットルの細菌懸濁液と混合します。混合物を摂氏37度で2時間インキュベートし、200RPMで振とうして、細菌ファージの再感染を防ぎます。その後、1ミリリットルの培養物を微量遠心チューブに移し、懸濁液を10,354gで2分間遠心分離する。ペレットを1ミリリットルのろ過済みLB培地で3回洗浄します。
洗浄後、ペレットを2x LBの1ミリリットルに再懸濁します。この混合物の20マイクロリットルを、市販LPSのミリリットルあたり0.8ミリグラムを含む1ミリリットルのろ過LBに加えます。そして、混合物を摂氏37度、200RPMで2時間インキュベートします。次に、10,354gで2分間遠心分離することにより、微量遠心チューブ内の培養物1ミリリットルをペレット化する。
細胞を濾過したLBで3回洗浄した後、1ミリリットルの濾過したLBに再懸濁します。真空ろ過システムを使用して、1ミリリットルの細菌懸濁液を滅菌0.45ミクロンフィルターに通し、100ミリリットルのろ過されたLBを使用してフィルターをすすぎます。滅菌鉗子を使用してフィルターをフラスコに移します。2ミリリットルの2x LBをフィルターに加え、ピペットで数回ピペットしてフィルターから細胞を放出します。1ミリリットルの細胞を10,354gで2分間遠心分離し、ろ過したLBで3回洗浄します。採取した細胞を2×の1ミリリットルに再懸濁 LB.To、ファージフリー接種物を調製し、細菌懸濁液から100マイクロリットルの細胞を0.45ミリグラム/ミリリットルLPSを含有する900マイクロリットルのLBに加える。
200 RPMで振とうしながら、摂氏37度で24時間インキュベートします。これをアリコートとして使用して、ファージの再感染がないことを確認します。プロトコールの異なる段階で滴定を行うことにより、洗浄とろ過を繰り返すだけでは、培養物からバクテリアファージを除去するのに十分ではないことが観察されました。
しかし、市販のLPSとのインキュベーションのステップが採用されたとたんに、ファージの数は減少しました。細菌培養中の細菌ファージを完全に除去するための重要なステップは、市販のLPSとの2回目のインキュベーションでした。
