まず、200マイクロリットルの100ミリモル塩化ナトリウムを、naegleria gruberiのトランスフェクションされた栄養型を含むチューブに加えます。チューブを600Gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞ペレットを100ミリモルEDTAの100マイクロリットルに再懸濁します。
チューブを98°Cのヒートブロックに15分間入れて、細胞を溶解します。チューブを摂氏4度で最高速度で10分間遠心分離し、破片をペレット化します。上清を新しいチューブに移します。
次に、0.5容量の酢酸アンモニウム、3容量の無水エタノール、および1マイクロリットルのグリコーゲンを上清に加えます。チューブを数回反転させて混合した後、マイナス80°Cで30分間または一晩インキュベートします。インキュベーション後、チューブを室温で10分間16, 000Gで遠心分離します。
ペレットを乱さずに上清を取り除き、遠心分離する前に200マイクロリットルの70%エタノールを加えて洗浄します。乾燥させたペレットを滅菌脱イオン水に再懸濁して、マイクロリットルあたり10, 000トロフォゾイトのトロフォゾイト密度を達成します。トランスフェクションされたDNAに特異的なプライマーを用いたPCRと形質転換栄養型の検出後、CEREサンプルに2マイクロリットルの6Xローディング色素を加えます。
次に、染色したサンプルを0.8%アガロースゲルにロードします。ゲルを1.5〜2時間電気蛍光した後、100ミリリットルの脱イオン水で希釈したDNA色素でインキュベートします。染色したゲルを脱イオン水に20分間移し、染色します。
紫外線システム上でゲルを可視化し、結果を文書化します。PCR解析では、トランスフェクションした栄養型でpGRUBが少なくとも7つの継代を通じて検出されたことが示されました。pGEMは最初の通過後に失われており、空のプラスミドがアメーバによって保持されていなかったことを示しています。
