まず、マスターバッファを準備します。0.22μmの孔径フィルターでろ過し、バッファーを4°Cで保存します。次に、マスターバッファーに3つのEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤、2ミリモルATP、および0.1ミリモルDTTを添加して、75ミリリットルの抽出バッファーを調製します。
次に、ミオシンVIIAを発現する凍結細菌細胞ペレットに75ミリリットルの抽出バッファーを加え、ペレットを氷上の抽出バッファーに解凍するまで放置します。その後、血清ピペットを使用してペレットを分解し、解凍プロセスを加速します。次に、5秒オンと5秒オフのハーフインチチップを使用して、50%の振幅で氷上で再懸濁液を10分間超音波処理します。
総溶解物を33,746Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離中に、抗FLAGアフィニティー樹脂の50%スラリー3ミリリットルを40ミリリットルのPBSで洗浄して、1.5ミリリットルのFLAG樹脂を調製します。その後、樹脂を800Gで4°Cで2分間遠心分離します。
PBSはレジンを乱さないように慎重に取り除きます。次に、ライセート遠心分離からの上清を洗浄した樹脂に加え、摂氏4度で連続回転させて1時間インキュベートします。樹脂を800Gで4°Cで2分間遠心分離してペレット化します。
そして、レジンを乱さずに上澄み液を取り除きます。次に、樹脂を40ミリリットルのマスターバッファーに再懸濁し、800Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。上澄み液はレジンを乱さないように慎重に取り除きます。
次に、洗浄したレジンを2本のポリプロピレン製スピンカラムに移します。各カラムを2ミリリットルのマスターバッファーで1回洗浄します。次に、カラムを1,400Gで摂氏4度で2分間遠心分離し、マスターバッファーを除去します。
溶出バッファーを調製するには、1ミリリットルあたり100マイクログラムのFLAGペプチドをマスターバッファーに加えます。各カラムに充填した樹脂に300マイクロリットルの溶出緩衝液を添加します。ピペッティングで穏やかに混合し、レジンが溶出バッファーによって完全に水和していることを確認します。
次に、カラムを1,400Gで4°Cで2分間遠心分離します。流れをきれいなマイクロ遠心チューブに移し、氷の上に保ちます。次に、溶出画分でSDS-PAGEを実行し、それらの相対濃度を決定します。
ゲルが泳動している間に、所定の組成物で透析緩衝液を調製します。次に、最も濃縮されたフラクションを組み合わせます。サンプルを 10, 000 分子量カットオフ透析カセットに移し、摂氏 4 度で一晩透析します。
翌日、透析カセットからサンプルを慎重にアンロードします。PCRチューブあたり15マイクロリットルを分注し、チューブを液体窒素の容器に落として瞬間凍結します。精製されたミオシンVIIA複合体はSDS-PAGEによって確認され、200 kgダルトンマーカーより上にはミオシンVIIA重鎖に対応するバンドが示され、22キロと14キロのダルトンマーカーの間にはRLCカルモジュリンとカルモジュリン様タンパク質を表す3つの異なるバンドが示されました4。
