まず、精製したヒトミオシン-7aタンパク質を500ミリモル塩化ナトリウム運動緩衝液中の1チャンバー容量をフローチャンバーに加え、室温で5分間インキュベートします。150ミリモル塩化ナトリウム運動緩衝液中で、1ミリグラム/ミリグラムBSAの3チャンバー容量でフローチャンバーを洗浄します。その後、出口できれいなワイプを使用して液体を引き出し、余分な液体を吸収します。
次に、150ミリモル塩化ナトリウム運動緩衝液中の10ナノモルのロダミン-ファロイジン標識F-アクチンの1チャンバー容量をフローチャンバーに流します。アクチンフィラメントの表面への結合を、100倍対物レンズを用いた蛍光顕微鏡で観察します。トラッキングに最適なアクチンフィラメント密度を確保し、視野内に十分なフィラメントを確保しながら、オーバーラップを防ぐのに十分なほどまばらにします。
次に、150ミリモル塩化ナトリウム運動緩衝液の3チャンバー容量でフローチャンバーを洗浄し、結合していないアクチンフィラメントと過剰なロダミン-ファロイジンを除去します。運動性を開始するには、最終バッファーの1つのチャンバーボリュームをフローチャンバーに追加します。次に、561ナノメートルの励起を使用して蛍光顕微鏡で画像を記録し、ロダミン-ファロイジン標識アクチンを視覚化します。
スライド上で目的のアクチン密度の領域を見つけ、30秒ごとに30分間画像をキャプチャします。次に、GitHubリポジトリからFastプログラムをダウンロードしてインストールします。Python 3 互換バージョンであり、ND2 ファイル変換用の追加モジュールがあることを確認します。
許容値33を使用して高速プログラムを実行し、滑らかに動くフィラメントのみを保持します。その後、高速プログラムを使用して、新しく作成されたTIFF画像を分析します。x の最大値を 20, 000 ナノメートルに設定し、y の最大値を 20 ナノメートル/秒に設定して、最長のフィラメント長と最大フィラメント速度を表します。
次に、px を使用して、取得した画像のピクセル サイズを 65 ナノメートルに設定します。minVを0.1ナノメートル/秒に設定すれば、フィラメントを解析に含めるために必要な最小速度です。フィラメントをリンクするフレーム間の最大距離を設定するには、maxDを使用して、フレーム間で別々のフィラメントをリンクしないようにします。
pt を使用して、フィラメント速度の変動に対する許容値を設定します (滑らかな動きのフィラメントのみを含む)。最後に、分析用の TIFF スタックを含むフォルダーを示すために d を使用します。アクチンフィラメントグライディングアッセイでは、ミオシン-7aの運動性が遅いことが示され、ビデオ再生は動きを視覚化するために500倍高速化されました。
ミオシン-7aの速度分布は、毎秒5ナノメートル未満のピークを示し、その遅い運動性を確認しました。
