マクロファージ感染アッセイにおける Mycobacterium abcessus を標的とする化合物の抗菌活性と毒性評価

野生型成体マウスの骨髄からマクロファージを誘導するには、10%FBSと10%LCCMを添加したDMEMを含む96ウェル光学処理平底プレートに骨髄細胞をプレートします。細胞を摂氏37度で7%二酸化炭素と10日間インキュベートします。分化後、75マイクロリットルのMycobacterium abscessus懸濁液をウェルを含むマクロファージにピペットで入れます。

細胞を摂氏37度で7%二酸化炭素と4時間インキュベートします。小型カセットを装備したマイクロプレート試薬ディスペンサーを使用して、10%FBSおよび10%LCCMを添加した110マイクロリットルのDMEMを化合物または溶媒制御カラムに加えます。10%FBSおよび10%LCCMを添加したDMEMをさらに104マイクロリットル分注し、最高濃度の化合物または溶媒を含むカラムに分注します。

次に、5.9マイクロリットルの化合物または溶媒をカラム内の指定されたウェルにピペットで入れます。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、化合物と溶媒ごとに2回の段階希釈を行います。最後の希釈後、最後のウェルから余分な110マイクロリットルの培地を廃棄します。

ブランクウェルを除くすべてのカラムに、10%FBSおよび10%LCCMを添加した110マイクロリットルのDMEMを添加します。DMEM中にクラリスロマイシンの溶液を1ミリリットルあたり2マイクログラムの濃度で調製します。インキュベーション後、感染したマクロファージを含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。

プレートウォッシャーを使用して、200マイクロリットルの感染洗浄液で細胞を3回洗浄します。200マイクロリットルの化合物を、感染したマクロファージを含むプレートに移します。次に、200マイクロリットルの補充細胞培養培地とクラリスロマイシン溶液をそれぞれのウェルに加えます。

プレートを摂氏37度で7%二酸化炭素と48時間インキュベートします。インキュベーション後、感染細胞を200マイクロリットルの化合物洗浄液でそれぞれ3回洗浄します。マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、200マイクロリットルの固定溶液をすべてのウェルに分注し、10分間インキュベートします。

細胞を洗浄した後、200マイクロリットルの透過性溶液をすべてのウェルに移し、15分間インキュベートします。次に、透過性溶液を吸引してから、100マイクロリットルの染色溶液をすべてのウェルに加えます。室温で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、化合物の洗浄液200μリットルで細胞を3回洗浄します。ハイコンテントイメージングシステムを使用してプレートをスクリーニングするには、プレートタイプとして96マイクロタイタープレートを選択します。対物レンズは 20X で、開口数は 0.4 で、モードは共焦点です。

その後、DAPI、CellMaskディープレッド、mCherryチャンネルを選択して、染色された核、細胞質、および細菌シグナルをそれぞれ捕捉します。プレートのウェルと、分析する各ウェルのそれぞれのフィールドを選択します。次に、テストをクリックして画像をキャプチャし、設定を確認します。

最後に、機器ハンドリングロボットをセットアップして、画像取得を夜間に自動化します。このロボットアームは、人間の介入なしにハイコンテントイメージングシステムのプレートを交換します。化合物のダウノルビシン、ドキソルビシン、チオストレプトン、エピルビシン、およびパモ酸ピルビニウムは、マイコバクテリアに感染したマクロファージに対して毒性があり、細胞生存率は85%未満でした。

化合物モキサラクタムとベシフロキサシンは、13.3マイクロモルでマイコバクテリアの生存率が50%未満でしたが、DMSOコントロールと有意差は示されませんでした。化合物セフジニル、ガチフロキサシン、およびモキシフロキサシンは、13.3マイクロモルで細胞内マイコバクテリアに対して強力で、パモ酸ピルビニウム化合物が最も活性でした。化合物、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、およびリファブチンは、細胞内マイコバクテリアに対して極めて高い効力を示し、クラリスロマイシンはマイコバクテリウムの生存率を全濃度で10%未満に低下させました。