We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1細胞培養注：米国農務省農業研究サービス（フォートピアス、フロリダ州、米国）での博士ウェイン·ハンター研究所によって確立Homalodisca vitripennisた細胞株は、初期線維芽細胞及び単層を含む混合細胞の段階で構成されるラボ株式を開始するために使用された。 <ol><li> 25cm 2の培養フラスコを20〜24℃の温度範囲に維持され、無菌の実験室環境では、次の手順を実行します。 </li><li>育成とH2G +ヨコバイ媒体、修正されたWH2ミツバチメディア10（ 表1）を使用して25cm 2の組織培養フラスコに培地を維持する。 </li><li> 〜53％の湿度で24℃で培養フラスコをインキュベートする。 </li><li> 例えば、培養増殖をモニターし、異常な細胞増殖のためにチェックし、潜在的な汚染物質を監視し、CULを越え、成長の進行状況をチェックするために100Xの総合倍率（TM）での倒立顕微鏡を使用してくださいトゥーレ表面。 </li><li>培養表面を乱すことなく10日 - 7日毎完全培地変化（フラスコあたり〜4ミリリットル培養培地）を実行します。 </li><li>培養表面が、細胞を解離するためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含む0.25％トリプシンを用いて細胞増殖（コンフルエント）によって覆わ約80％である場合、培養物を通過させる。各培養フラスコにトリプシン3ミリリットルと短期間酵素に培養物（複数可）を公開する - 〜2の追加 - 完全な細胞解離を達成するために、（5〜10分）。 </li><li>酵素活性を停止し、遠心分離コニカルチューブにソリューション全体を転送するために - （3mlの〜2）培養フラスコ（複数可）に新鮮な培地を同量を追加します。 </li><li> 350×gで6分間、4℃で遠心分離により細胞をペレット化。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、各チューブに新鮮な培地〜8ミリリットルを追加します。静かにピペットを用いて細胞をホモジナイズする。 </li><li> 1での分割培養：2比25 cm 2のフラスコ（〜セルsoluti 4mlのフラスコ当たりで）及び新たに渡された文化を残して、懸濁液中の細胞がフラスコの表面にしっかりと付着させ48時間平静。 注：1cm 2の成長表面を有する48ウェル滅菌組織培養プレート中の細胞の培養も可能であり、それらは〜250μlのに培養培地の体積の減少と培養フラスコと同様に維持することができる。 </li></ol> 2全ウイルスの抽出<ol><li>ウイルス陽性のHの体全体を均一化〜10秒間隔ボルテックス0.02％のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（DETCA）とリン酸緩衝液中vitripennis、pH約7.2、ノー存在する組織のより大きな塊がなくなるまで。 4℃または4℃で16時間22000×gで4時間124,500×gで超高速遠心分離を経由してウイルスを抽出します。一番上に沈殿物が形成した場合、滅菌綿棒11でそれを削除してください。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>ペレットを収集し、0.4％のNa-デオキシコール酸および4％のポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ブリジ52）を含む、5ミリリットルの10mMリン酸緩衝液（無DETCA）、pH約7.2で溶解する。 <ol><li>よくペレットを混合するために、チューブの側面からペレットを除去し、必要に応じて、溶液中まで押しつぶす。 </li><li>ペレットは、必要に応じて溶液中に行くと2のチューブ11内に組み合わせる助けるために〜5ミリリットル刻みで、10 mMのリン酸緩衝液を追加します。 </li></ol></li><li>遠心分離し、15分間11、300×gでソリューションを提供します。 </li><li>上清を除去し、0.45μmのフィルターを通して溶液を渡し、大規模なコレクションチューブ11内のろ液を収集します。 </li><li> 3.5 kDの分子量カットオフ（MWCO）を用いて透析膜に転送するろ液、11を必要に応じて何DETCAを含まないリン酸緩衝液（pH7）に10 mMの少量を使用した。 </li><li> 4℃でのddH 2 Oで満たされた大きなビーカーに透析膜を配置します。のddH 2 Oを1時間ごとにFを変更するまたは5から6時間後、膜11中の白色の沈殿物が形成されるまで。 </li><li>膜内から精製されたウイルスを回収し、のddH 2 O を 90μlに溶液10μlを添加することによって、10倍希釈シリーズに、100％のウイルス液を施す：100,000その後1の希釈に達するまでのddH 2 Oをさらに90μlに希釈液10μlを加える。 </li><li> -80℃で保存ウイルス液。 </li></ol> 3。ウイルス複製<ol><li> 48ウェル培養プレートにおける種子細胞と細胞増殖が80％コンフルエント（細胞が平均速度で成長している場合は約72時間後に合格）になるまで、すべての行を育てる。 </li><li>一番上の行を除いて、 等 100希釈、：細胞増殖がコンフルエント、 すなわち、1:10希釈、1つの行の一つの行に達する連続希釈したウイルスを用いてセルの各行に接種する。コントロールとして一番上の行を使用し、ボリュームコントロールなどの各ウェルにのddH 2 O10μlのを追加します。 <ol><li>前ウイルスと培養中のいずれかの井戸の最初の接種に、各行の最初のウェルを、実験的な細胞数と比較するための出発ベースライン細胞濃度を確立解離とカウントするため。 </li></ol></li><li> pH変化を示す培地中のいずれかの色の変化のためと細胞形態の変化のためのウイルス接種後、培養プレートを24時間毎に監視します。 </li><li> 100X TMに倒立顕微鏡を用いて、各時点で試験板の画像つの列。 </li><li> -80℃でRNA抽出とウイルス定量化または長期-20℃でそれぞれ24時間の時点で撮像された列からすべてのメディアを取り外し、短期的に保管してください。 </li><li>再懸 ​​濁細胞ペレに酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、1.9の新鮮な培地〜250μlの-以前のステップ1.6で説明したように培地を除去した後、ウェルから細胞を解離させるトン。 </li><li>一週間にわたって各24時間の期間のための細胞解離後の細胞数を実行するための細胞を含有する各チューブに0.4％トリパンブルー染色液10μlを追加します。汚れが細胞数を実行する前に、10分間静置する。 <ol><li>汚れや生細胞への曝露の1時間以内に細胞数を実行すると、汚れだけでなく、非生存細胞を取り込むために開始されます。 </li></ol></li><li>ゆっくりとマイクロピペットを用いて、標準的な血球計数器の両側に染色された細胞溶液10μlを加える。溶液を、気泡を避けるために、毛管作用によって取り込まれることを可能にする。 </li><li>血球計数器の両側に実行可能な（非染色）細胞（血球計数器16の正方形の4カウントに相当）の数をカウントします。削除された列の各ウェルのために細胞数を実行します。 </li><li>各列からの細胞数を平均し、全細胞カウント数取得するには、次の式を使用します。x希釈係数（セル/ 4の平均数）=セル×10の数を<suP&gt; 4ミリリットル。これは、培養中の細胞密度または生存細胞の数である。 </li></ol>細胞培養から4ウイルスの抽出<ol><li>処理されたHを削除する1.8酵素活性を停止させ、0.25％トリプシンEDTAおよび新鮮培地のみ〜250μlのを使用して、 -以前のステップ1.6で説明したように培養フラスコから細胞をvitripennis。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 2.8 -以前のステップ2.3で説明したプロトコルに従って、培養細胞からウイルスを抽出します。 </li></ol> 5。RNA抽出<ol><li>製造業者のプロトコルごとの液体サンプル用に設計されたグアニジニウムチオシアネート - フェノール - クロロホルム抽出を使用して、各1週間のウイルス試験中に回収した培地のサンプルからRNAを抽出します。 </li><li>ストアを-80℃でサンプルを抽出した。 </li></ol> 6 RT-PCR <ol><li>使用した伝統的なPCR法を実行して、RT-PCRのためのウイルスの基準を確立ウイルスとのプライマー対HOCV RT-PCRプライマー1（フォワード5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;、5&#39;-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3を逆転&#39;）全身H.から分離するvitripennis。 </li><li>主題PCR産物は、0.1％臭化エチジウムを含む2％アガロースゲルで120 Vで60分間電気泳動をゲル化する。 </li><li>ゲルからのバンドを切り出し、製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キットを用いて精製する。 </li><li>プールは、すべて切除し、ゲル精製し、製品と、さらに基本的なエタノール沈殿により精製し。全体的な試料濃度を増加させるためにトリスEDTA（TE）の約30μlの沈殿生成物を溶出する。 </li><li>核酸検出のための260/230波長設定を使用して分光光度法を介してプールされたサンプル中のcDNAのレベルを定量化する。 </li><li> 57 ngの/ 57 AG /μL（10 -18）μLの範囲までの精製標品の10倍連続希釈系列を実行します。 iを記載したものと同様の連続希釈を行うnの濃度の要件の違いのために作ら調整を2.8。 </li><li>低存在転写産物の信頼性の高い定量化と定量RT-PCRキットを使用して定量RT-PCRを行うことによって希釈系列の検出限界を決定します。 注：5×10 -3コピーよりウイルス濃度は低いが検出されない。 </li><li>ステップ5.1で、前述のように実験試料からRNAを抽出し、分光光度法を使用して定量化する。 </li><li> 5 ngの/ヌクレアーゼを含まない水を使用してμlに抽出されたすべてのサンプルを正規化します。 </li><li>次のように低コピー数を感知する能力を持つワンステップ定量RT-PCRキットを用いて25μlの反応として、二重に、すべての試料について定量RT-PCRを行う：50℃で10分間保持し; 5分間95℃で保持。 10秒、30秒、60°C、95°Cの30サイクル;各ステップでの5秒間99℃ - 50から溶融。 <ol><li>各反応混合物は1倍maste12.5μlのが含まれているように、マスターミックスを作るRミックス、フォワードプライマー1.0μL（0.3μM）、リバースプライマー1.0μL（0.3μM）、逆転写酵素および標準化値に基づいて、テンプレートの可変量の0.25μlの。 </li><li> RNaseを含まない水で25μlの総反応容量を持参してください。 </li><li> 5×10 -10、5×10 -8、5×10 -6、5×10 -4、5×10 -2のコピー：各PCRの5つの標準濃度以下のコピー数を使用して実行を含めます。各実行の開始時に早期取得時のノイズを低減するためにちょうど10倍-2.5の蛍光の下にそれぞれの実行のためのしきい値を設定します。 </li></ol></li></ol> 7。共焦点顕微鏡<ol><li>各ウェルに直径18mmのガラス製カバースリップを含む12ウェルプレートにHomalodisca vitripennis細胞を成長させる。 </li><li>単層が達成された後、四日間の期間プレートに24時間毎に1つの列に接種する。各Cことを確認してくださいolumnがうまくコントロールが含まれている、低ウイルス希釈（1:10）だけでなく、高いウイルス希釈（1：100,000）よく。ステップ2.8から得られたウイルス溶液を使用してください。 </li><li> 5日目にすべてのメディアを取り出して、1×PBS（pH7.4）で細胞を2回洗浄する。 </li><li> 30分間、4℃での冷4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li><li> 1Xリン酸500μlの細胞に緩衝食塩水（PBS）を追加し、低速でロッカー上、室温で10分間、それらを洗ってください。細胞を3回洗浄する。 </li><li>それらを透過するために、細胞を0.1％トリトンX-100の500を添加する。室温で10分間放置します。 </li><li>先にステップ7.5で説明したように、再び細胞を洗浄する。 </li><li> RTで細胞をブロックするために、5％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液500μlを加える。 2時間放置した後、削除してみましょう。 </li><li> ×PBS中5％BSAを含む250およびF-アクチンのため汚れに各ウェルに希釈液を250μlを追加：在庫ローダミンレッド - 結合ファロイジン（RCP）1に希釈する。 </li><li>アルミFのカバープレート漂白から染料を防止し、4℃のCO / Nで細胞を培養するためのオイル。 </li><li>インキュベーションの12時間後にRCPを除去し、4を250μlと交換して &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）（250μg/ ml）を、5％BSAを含む1×PBS中に希釈し、細胞の核を染色する。 </li><li>室温で1時間DAPIを含有する細胞をインキュベートする。 </li><li>先にステップ7.5で説明したように1×PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>静かに井戸からカバースリップを除去し、抗退色試薬とマウントメディアを使用してスライドを顕微鏡にマウントします。 </li><li>共焦点顕微鏡下で観察されるまでスライドを遮光箱に乾燥することができます。 Viewは、できるだけ早く染料が急速にフェードすることができますようにスライドを用意しました。 </li><li> 63X（油）は平面-apochromateレンズを含む顕微鏡を備えた共焦点顕微鏡システムを用いて画像染色された細胞。 <ol><li> 543±10nmの励起及びRhoadmine赤conjucatedファロイジン575±10 nm発光レーザの波長を設定しますDAPI用、および369±10nmの励起及び450±30 nm発光。 </li><li>すべての画像を取得するために、検出器のために、同一のゲインとオフセットの設定を使用します。 </li><li>ソフトウェアを管理イメージに適切な画像処理ソフトウェアおよびソーティングおよびインポート所望の画像を用いて処理画像。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

侵略的な農業の種の流入に関するライジング懸念は、新興害虫や病原体から身を守るための新たな方法論の需要増加につながりました。病気の予防と管理の焦点は、病原体のベクトルの管理を含み、この研究の主な対象となった。経済性、実用的なアプリケーションは、大面積にわたって、低コスト12に大量である必要があるため、農業において、病原ベクトルを管理するためのバイ...

（Homalodisca vitripennisゲルマール1821）ガラス状の翼狙撃兵はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、北米1ブドウ（PD）のピアース病の原因因子の優勢なベクトルとして同定されている。昆虫個体群管理はすぐにカリフォルニアのブドウ栽培産業へと南部米国各地、この破壊的な問題に対処するための研究の焦点となっている。家族Dicistroviridae、Homalodisca coagulataのウイルス01（HOCV-01）に属するプラスセンス一本鎖RNAウイルスは、野生H.で同定されているvitripennis集団および殺虫剤に害虫の抵抗性を低下させながら、それらの集団2-4の死亡率を増加させることが示さ。 効果的にリアH.感染させる手法の開発実験室の設定で成体までvitripennisがあるため困難であった<eM&gt; H。 vitripennisは宿主植物5-8さまざまなを必要とする別のステージ特異的な栄養ニーズを持っている。具体的な施設は、リアライブHに必要とされる米国ではvitripennis;そのため、細胞培養は、より経済的で実行可能な代替だけでなく、HOCV-01の検出およびレプリケーション2,9にとってますます不可欠です。 H.の細胞培養を確立するための基本的な方法は、一方vitripennisが記述され、これらの方法はまだ、このようなウイルス2のような生物的防除剤の商業生産のために利用されていない。 次の手順の全体的な目標は、生物的防除剤としての利用に適しHOCV-01を高濃度で製造することである。ウイルス複製がなぜ成功し、Hを栽培し、最適化された生細胞を必要とし、 vitripennis培養は、ウイルスの収益性の高いレベルを生成するの進展に不可欠です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;cell culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25&#160;cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA &#8226; 4Na per liter of Hanks&#8242; Balanced Salt Solution with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8937</td>
			<td>48 wells (TC treated with lid)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DETCA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>228680</td>
			<td style="width:167px;">Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;bottle-top vacuum filter system</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431206</td>
			<td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45&#160;&#956;m, membrane area 54.5&#160;cm2, filter capacity 500&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Brij 52</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>388831</td>
			<td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5244</td>
			<td>Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">TRIzol LS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>For electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7637</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect qRT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>204243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td style="width:167px;">Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Rhodamine red-conjugated phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>R415</td>
			<td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM510 Meta Confocal System&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM Zen 2007 Software</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grace&#8217;s Insect medium (supplemented, 1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8142</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-histidine monohydrate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H8125</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 199 (10X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 1066 (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0422</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salts (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51322C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM, amino acid mix (50X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>56419C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 M MgCl solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pen-Strep (w/ Glutamine)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G6784</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nystatin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>N6261</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46305</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

ガラス状の翼狙撃兵（Homalodisca vitripennis）は米国南西部で発見、非常vagileと雑食昆虫です。これらの昆虫はXylella fastidiosa（Xにfastidiosa）、ブドウのピアース病（PD）の病因である木部が制限された細菌の優勢なベクトルである。ピアース病は、経済的に有害である。したがって、H. vitripennisは、病原体管理戦略のターゲットとなっている。 Homalodiscaのcoagulataウイルス-01（HOCV-01）と同定dicistrovirusはHの死亡率の増加と関連していたvitripennis集団 。宿主細胞はHOCV-01の複製に必要とされるため、細胞培養は、ロジスティックや生物農薬生産のための経済的価値がある目標と複製のための均一な環境を提供します。 H.の大規模増殖のために本研究では、システムpを組織培養を介した細胞が開発されたvitripennisウイルス複製のメカニズムをroviding。 HOCV-01は、全身昆虫から抽出され、培養されたH.に接種したさまざまなレベルで細胞をvitripennis。培養培地は168時間、24時間毎に除去し、RNAを抽出し、定量RT-PCRで分析した。細胞は、トリパンブルーで染色し、光学顕微鏡を用いて細胞生存性を定量化するために計数した。全ウイルス粒子は、全細胞培養崩壊が発生する前であると判断した時点であった、感染後96時間までの抽出された。細胞はまた、蛍光染色を施し、F-アクチンの取り付けおよび核完全性に対するウイルス活性を調査するために、共焦点顕微鏡を用いて観察した。この研究の結論は、Hである。 vitripennis細胞を培養し、バイオ農薬の生産を可能にするために適切なレベルでHOCV-01の大量生産のために使用されることが可能である。

細胞の付着および成長が一次培養し、継続的な通路から、小規模および大規模の両方の培養フラスコ中の通路の48時間以内に見られた。線維芽細胞成長および発達にも、この時間枠内で観察された。新たに播種したフラスコは、48時間前に妨害されたとき、そこに、細胞の接着では見え下落したこともある遅い成長している文化や全く付着または成長につながる。細胞は、通過する一週間以内...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。

の伝播<em&gt; Homalodisca coagulataウイルス01</em&gt;経由<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt;細胞培養

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.6K ビュー.  University of Texas at Tyler. ここでは、in vitroでHomalodisca vitripennis細胞やHOCV-1を伝播するためのプロトコルを提示する。媒体はHOCV-1陽性培養物から除去し、RNAを168時間ごとに24時間抽出した。細胞生存率をトリパンブルー染色によって定量した。全ウイルス粒子は、感染後抽出した。抽出されたRNAは、定量RT-PCRによって定量した。 

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Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

免疫・感染学

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

感染症のためのモデルとしてのオルガノイド：人間の文化とマウス胃オルガノイドとピロリ菌のマイクロインジェクション

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;結核病変における薬物侵入を予測するカゼウム結合アッセイ

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

巨小胞内部の単細胞レベルにおける細菌細胞培養

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

腹部大動脈瘤マウスモデルにおける脈拍伝播速度、分解性およびひずみの測定

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

バイタル顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚におけるマイコバクテリア感染時のマクロファージ溶解細胞死の可視化

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

アエデスアエジプティ蚊における微小胞体寄生虫・エダリア・アダイスの伝播

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...