Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de DK074656 AI56374 (CEM), ainsi que la Juvenile Diabetes Foundation Research.

1. Préparation des cellules <ol><li> Culture de cellules cibles: la culture de lignées de souris des cellules bêta, NIT-1-4 et aux NTIC, a été un 1,2 précédemment décrit dans DMEM supplémenté avec 10% de FBS, BSA 0,02%, non-acides aminés essentiels, 15mm HEPES, 16.5mm Glocose et pénicilline / streptomycine. Pour 51 d&#39;étiquetage Cr, les cellules des graines dans un fond plat plaque de 96 puits de culture au 5X10 4 cellules / puits dans 200 ul milieu de culture. Pour des expériences de microscopie, les cellules des graines dans un 8-même Lab-Tak lamelle II chambrés à 5x10 4 par chambre dans un milieu de culture 500 ul, et permettre de croître pendant 48 heures avant d&#39;utiliser dans les expériences de cytotoxicité. </li><li> Contrôle de la culture lignée cellulaire T: Utilisez la lignée cellulaire Jurkat (ATCC, CD3 + humaines lignée cellulaire des lymphocytes) comme contrôle négatif. Cellules Jurkat Culture en RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 2 mM L-glutamine, le bicarbonate de sodium 1,5 g / L, 10 mM d&#39;HEPES et 1,0 mM pyruvate de sodium. </li></ol> 2. Collecte et l&#39;activation des effecteurs autoréactifs des cellules T CD8 + NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] et NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] ont été achetés auprès de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) et élevés dans notre installation de la souris. F1 descendance hybride de croisements de souris NOD-AI4a avec NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] développent un diabète à 3-5 semaines d&#39;âge. Toutes les souris ont été logés dans des installations exemptes d&#39;agents pathogènes et approuvé par les soins des animaux de l&#39;institution concernée et le Comité d&#39;utilisation. <ol><li> Euthanasier 3-4 semaines vieilles NOD-AI4a / b des souris en utilisant du CO 2. </li><li> Recueillir les rates de souris. Souris euthanasiés sont préparés par pulvérisation d&#39;éthanol et ouvert sous le capot chirurgicale. Rates sont prélevées et mises en tampon glacé HBSS immédiatement. </li><li> Recueillir les cellules spléniques en utilisant un verre de 7 ml homogénéisateur. Deux à trois rate chacun sont mis en 5 ml de HBSS froid et homogénéisé avec un homogénéiseur 7 ml en verre. Homogénat est recueilli et centrifugé à 1200rpm pendant 5 minutes à 4 ° C en utilisant une centrifugeuse Sorvall RT7 +. Les culots cellulaires sont collectées. </li><li> Enlever les globules rouges en utilisant un traitement solution hypotonique. Les pellets sont traités par 5 ml de solution hypotonique / rate sur la glace pendant 5 minutes, puis neutralisé par addition d&#39;un volume égal de HBSS. Recueillir les cellules par centrifugation, comme ci-dessus, et remettre en suspension dans 50 ml de HBSS. Passez les cellules en suspension grâce à la crépine de cellule et de compter à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre avec coloration TrypanBlue. </li><li> Activer les cellules. Resuspendre les cellules à 5x10 6 / ml et activer à l&#39;aide d&#39;une culture de 3 jours avec 0,1 pM AI4 mimotopes (amino YFIENYLEL séquence d&#39;acides) et 25 U / ml d&#39;IL-2 dans RPMI1640 complété avec 10% de FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g / bicarbonate de sodium L, HEPES 10 mM et 1,0 mM pyruvate de sodium. </li></ol> 3. 51 test de libération de Cr pour examiner la LMC <ol><li> Cellules cibles Label: Ajouter 51 Cr pour cibler les cellules à 1 pCi / puits et la culture pendant 3 heures, et laver 3 fois avec un milieu de culture. </li><li> Suspendre les cellules effectrices en milieu RPMI 1640 tel que mentionné dans l&#39;étape 2.5 de sorte que le volume final ajouté à chaque puits est de 200 pi. </li><li> Après le lavage final des cellules cibles marquées, ajouter activé des cellules effectrices aux cultures de cellules cibles à effecteur souhaitées à la cible (E: T) des ratios. Nous utilisons habituellement E: ratios T à 0,4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 et 50:1. </li><li> Ajouter frais de modification du milieu RPMI 1640 (voir étape 2.5) à 6 puits de cellules cibles à agir comme un contrôle lyse spontanée. </li><li> Co-culture des cellules effectrices et cibles pendant 16 heures. </li><li> Recueillir le surnageant dans des tubes de verre 6x50 mm Lime </li><li> Lyse des cellules en ajoutant 100 ul de 2% de SDS et de pipetage plusieurs fois délicatement. </li><li> Recueillir lysat cellulaire dans un autre ensemble de tubes de verre 6x50 mm Lime. </li><li> Laver les puits une fois avec nettoyage H 2 O et ajouter le lavage pour les tubes lysat cellulaire. </li><li> Compter les surnageants et les lysats cellulaires en utilisant un compteur gamma. </li><li> Calculer lyse spécifique comme suit: <img src="files/ftp_upload/2724/2724eq1.jpg" alt="L&#39;équation 1" /></li></ol> 4. Coloration des cellules pour l&#39;imagerie de cellules vivantes Parmi les plus couramment utilisés colorants membrane mitochondriale potentiels, TMRM expositions de la toxicité mitochondriale au moins 3. Par conséquent, nous choisissons TMRM pour ces études d&#39;imagerie des cellules vivantes. <ol><li> Préparer une solution à 40 mM dans le DMSO TMRM et conserver à -20 ° C. Faites un [25 nM] une nouvelle solution de travail dans le rouge de phénol libre DMEM avec tous les suppléments pour NTI une culture cellulaire 1. </li><li> Tache cibles NIT-1 des cellules avec TMRM 25 nM pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Remplacez le support du milieu frais contenant 5 nM TMRM de maintenir la distribution d&#39;équilibre des 4 colorant. </li><li> Comptez effectrices activées AI4 cellules T utilisant un hématocytomètre. </li><li> Tache effectrices activées AI4 cellules T avec 1 pl / ml pour les Picogreen5 minutes à température ambiante et laver avec du rouge de phénol libre milieu de culture 3 fois. </li></ol> 5. Évaluation des lymphocytes T médiée par la mort des cellules bêta en utilisant l&#39;imagerie de cellules vivantes <ol><li> Montez la lamelle chambré avec des cellules NIT taché sur la scène d&#39;un Zeiss LSM 510 microscope confocal. Retirez la languette avec un dremmel gaz et de stériliser les chambrés en verre à l&#39;oxyde Etheline. Le stade est équipé d&#39;une chambre de l&#39;imagerie des cellules vivantes qui a contrôlé la température à 37 ° C et 5% de CO 2 avec l&#39;humidité. </li><li> Ajouter activé et colorées des cellules T à des chambres désignées à E différents: les ratios T. </li><li> Ajouté le même nombre de cellules Jurkat tachés aux chambres de contrôle. </li></ol> 6. Obtenir des images de cellules vivantes Le microscope est équipé d&#39;une platine motorisée, qui nous a permis d&#39;acquérir des images à plusieurs reprises à différents endroits des chambres identiques ou différents automatiquement au cours du temps de l&#39;expérience. <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 63x du pétrole, de prendre des images à un intervalle de toutes les 3 minutes pour un total de 300 images par emplacement. </li><li> Détecter coloration TMRM utilisant une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 543 nm et ensemble de filtres pour l&#39;émission de 565 à 619 nm </li><li> Détecter coloration Picogreen utilisant une excitation à 488 nm et un ensemble de filtres pour l&#39;émission de 500 à 630 nm. La vidéo a été créé en utilisant le logiciel LSM Zeiss. </li></ol> 7. Conversion vidéo pour la publication <ol><li> Utilisation du logiciel LSM Zeiss, créer un fichier vidéo compressé au format AVI. </li><li> Pour convertir la vidéo au format publié, importer la vidéo dans le logiciel FIDJI ( <a href="http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji">http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji</a> ), une ImageJ ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info. nih.gov / ij /</a> ) de la distribution, en utilisant le plugin Bioformats de loci ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats">http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats</a> ). </li><li> Réglez les paramètres de luminosité et le contraste pour équilibrer les signaux verts et rouges et le taux de trame a été fixé à 2 images / seconde en utilisant le menu des options animation. </li><li> Recadrer la vidéo à 512 x 512 pixels et d&#39;exporter dans un fichier AVI non compressé. </li><li> Ouvrir ce fichier AVI dans le logiciel QuickTime 7 (ordinateur Apple, à Cupertino, Californie) et de compresser et d&#39;exportation dans le format de fichier vidéo ouvert H264/MPEG-4 à 1200 kbs / seconde. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs: <ol><li> Un résultat représentatif de 51 Cr CML dosage. La figure 1 montre un résultat représentatif d&#39;un dosage de la LMC, où lyse pour cent spécifiques (axe Y) augmente à mesure que l&#39;effecteur: ratio cible (axe X) augmente. Les cellules cibles sont des îlots isolés de souris NOD primaires immunodéficientes Rag1-/ -. Souris et marquées au 51Cr. Splénocytes de NOD.AI4α / β souris transgéniques sont isolés et activés comme décrit dans l&#39;étape 2 ci-dessus. Les cibles et les effecteurs ont été co-cultivées pendant 16 heures. Lyse spécifique est calculé pour cent tel que décrit à l&#39;étape 3.11 ci-dessus. </li><li> Deux représentant (positives et négatives) des résultats d&#39;une médiation cellulaire T dissipation de cellules bêta membrane mitochondriale potentiels sont présentés. Les cellules sont colorées et les réactions sont enregistrées comme décrit dans les étapes 4, 5 et 6 ci-dessus, les fichiers vidéo sont créés comme à l&#39;étape 7. Vidéo 1: La lignée de cellules de souris beta-1 NIT était tachée du potentiel de membrane mitochondriale colorant TMRM (Rouge). Activé, autoréactifs lymphocytes T CD8 + AI4 (vert souillé avec Picogreen) ont été co-cultivées avec ces NIT-1 des cellules à un rapport E: T de 50:1. NTI-1 potentiel de membrane mitochondriale dissipée progressivement pendant une durée de 400 minutes, mais seulement dans les clusters qui ont été en interaction avec les cellules T AI4. Vidéo 2: Comme une expérience de contrôle, NIT-1 cellules ont été colorées avec TMRM et co-cultivées avec des cellules Jurkat Picogreen taché à un rapport E: T de 50:1. Les cellules Jurkat sont une lignée de cellules T humaines qui est MHC incompatibles. NTI-1 cellules maintenues potentiel de membrane mitochondriale pendant toute la durée de l&#39;400 minutes co-incubation période. Cellules Jurkat ne pas interagir avec NTI-1 grappes et donc, ne pas faire tuer. </li></ol><img src="files/ftp_upload/2724/2724fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 résultat représentatif de la LMC utilisant comme cellules cibles primaires îlots isolés de immunodéficientes NOD.Rag1-/ -. Splénocytes des souris et des NOD.AI4α / β de souris transgéniques. Les cibles et les effecteurs ont été co-cultivées pendant 16 heures. Lyse pour cent spécifiques augmente à mesure que l&#39;effecteur: augmente ratio cible. Vidéo 1. Lignée de souris des cellules bêta NIT-1 a été taché le potentiel de membrane mitochondriale colorant TMRM (Rouge). Activé autoréactifs lymphocytes T CD8 + AI4 (vert souillé avec Picogreen) ont été co-cultivées avec ces NIT-1 cellules au rapport E: T de 50:1. NTI-1 potentiel de membrane mitochondriale dissipationTed progressivement pendant une durée de 400 minutes, mais seulement dans les clusters qui ont été en interaction avec les cellules vertes T AI4. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/video.mov">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> . Vidéo 2. NIT-1 cellules ont été colorées comme décrit dans la vidéo 1 et co-cultivées avec Picogreen Jurkat T teinté lignée cellulaire humaine. NTI-1 cellules ont été capables de maintenir le potentiel de membrane mitochondriale pensé toute la durée de 400 minutes. Cellules Jurkat ne pas interagir avec NTI-1 grappes et donc ne pas faire tuer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2724/Video2.mp4">Cliquez ici pour visionner la vidéo</a> .

<ol>
	<li>Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIT-1,+a+pancreatic+beta-cell+line+established+from+a+transgenic+NOD/Lt+mouse.">NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse.</a> Diabetes. 40, 842-849 (1991).</li><li>Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mt-Nd2a+modifies+resistance+against+autoimmune+Type+1+diabetes+in+NOD+mice+at+the+level+of+the+pancreatic+beta+cell.">mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell.</a> Diabetes. , (2010).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+mitochondrial+polarization+and+depolarization+with+cationic+fluorophores.">Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores.</a> Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).</li><li>Abel, M., Krokowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+immune-mediated+(type+1)+diabetes+mellitus:+potential+for+immunotherapy.">Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy.</a> BioDrugs. 15, 291-301 (2001).</li><li>Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+resistance+of+ALR/Lt+mouse+beta+cells+to+autoimmune+destruction:+role+for+beta+cell-expressed+resistance+determinants.">Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).</li><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+mediated+cell+death+in+diabetes.">Mitochondria mediated cell death in diabetes.</a> Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).</li><li>Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+membrane+potential+(deltapsi(m))+in+apoptosis;+an+update.">The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update.</a> Apoptosis. 8, 115-128 (2003).</li><li>Dudek, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T-cells+from+T-cell+receptor+transgenic+NOD8.3+mice+destroy+beta-cells+via+the+perforin+and+Fas+pathways.">Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways.</a> Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).</li><li>Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+autoimmune+diabetes+the+transition+from+benign+to+pernicious+insulitis+requires+an+islet+cell+response+to+tumor+necrosis+factor+alpha.">In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).</li></ol>

Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université de Floride, les soins des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation.

Lymphocyte T cytotoxique médiée la mort des cellules bêta est la principale physiopathologie du DT1 5. Dosages de LMC en utilisant 51 Cr communiqué nous permettre d&#39;étudier le degré d&#39;effecteur-cible de réponse 6. Cependant, le processus détaillé et les voies de lymphocytes T de mort des cellules bêta n&#39;est pas encore pleinement comprise. Depuis les mitochondries sont critiques pour la fonction des cellules bêta et la mort 7, nous nous sommes concentrés...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Cr-51 </td><td> Perkin Elmer </td><td> NEZ030500IMC </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-60 </td><td></td></tr><tr><td> Tétraméthyl rhodamine ester méthylique (TMRM) </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td><td></td></tr><tr><td> Picogreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7581 </td><td></td></tr><tr><td> AI4 mimotope </td><td> mimotopes.com </td><td> séquence d&#39;acides aminés: YFIENYLEL </td><td></td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> R &amp; D </td><td> 485-MI </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Albumine de sérum bovin </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Cellgro </td><td> 25-060-Cl </td><td></td></tr><tr><td> MEM non-acides aminés essentiels </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td> Gemini </td><td> 400-109 </td><td></td></tr><tr><td> Le rouge de phénol DMEM sans </td><td> Sigma </td><td> D5303 </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur de CO2 </td><td> Thermo Fisher </td><td> HERAcell 150i </td><td> Maintenu stérile pour la culture cellulaire </td></tr><tr><td> Enceinte de sécurité biologique </td><td> Thermo Fisher </td><td> Forma 1440 </td><td></td></tr><tr><td> Des tubes de culture jetables, 6x50 mm verre à la chaux </td><td> Fisher </td><td> 14 à 958-A </td><td></td></tr><tr><td> Compteur gamma </td><td> Perkin Elmer </td><td> Assistant 1470 compteur gamma automatique </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM 510 Meta confocale </td><td> Avec platine motorisée et la chambre de cellules vivantes </td></tr><tr><td> Pipette (1ml, 200 pl, 20 pi, 10 pi, 2μl) </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubes (Ambre) </td><td> Fisher </td><td> 50819772 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse </td><td> Sorvall Legend RT + </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> Hémacytomètre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 267110 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope droit </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop40 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ Souris </td><td> Le Laboratoire Jackson </td><td> 004347 </td><td></td></tr><tr><td> NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ Souris </td><td> Le Laboratoire Jackson </td><td> 004348 </td><td></td></tr><tr><td> NOD-AI4α / β souris F1 </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Elevé en animalerie UF </td></tr></tbody></table>

methods to assess beta cell death mediated by cytotoxic t lymphocytes

Diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune cellulaire T. Pendant la pathogenèse, les patients deviennent progressivement plus insulinopenic que la production d&#39;insuline est perdu, sans doute cela résulte de la destruction des cellules bêta du pancréas par les lymphocytes T. Comprendre les mécanismes de la mort des cellules bêta au cours du développement du DT1 donneront un aperçu de générer un remède efficace contre cette maladie. À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages ont toujours utilisé le radionucléide chrome 51 (51 Cr) pour marquer les cellules cibles. Ces objectifs sont ensuite exposés à des cellules effectrices et la libération de 51 Cr par les cellules cibles est lu comme une indication de la mort cellulaire médiée par les lymphocytes. Les inhibiteurs de la mort cellulaire résulte de la libération diminué de 51 Cr. Comme les cellules effectrices, nous avons utilisé une population active autoréactifs clonale de cellules CD8 + lymphocytes T cytotoxiques (CTL) isolés à partir d&#39;un stock de souris transgéniques pour les deux chaînes alpha et bêta du récepteur AI4 cellules T (TCR). Activé AI4 cellules T ont été co-cultivées avec des cellules marquées au 51 Cr NIT cible pendant 16 heures, la libération de 51 Cr a été enregistré pour calculer lyse spécifique Les mitochondries participent à de nombreux événements importants physiologiques, tels que la production d&#39;énergie, la régulation de la signalisation de transduction, et l&#39;apoptose. L&#39;étude des cellules bêta mitochondriale changements fonctionnels pendant le développement du DT1 est un nouveau domaine de recherche. Utiliser le potentiel de membrane mitochondriale colorant rhodamine tétraméthyl ester méthylique (TMRM) et l&#39;imagerie confocale de cellules vivantes microscopiques, nous avons suivi le potentiel de membrane mitochondriale au cours du temps dans la ligne de la cellule bêta-1 NIT. Pour les études d&#39;imagerie, d&#39;effecteur AI4 cellules T ont été marqués avec fluorescent nucléaire coloration colorants Picogreen. NTI-1 et les cellules T ont été co-cultivées en chambrée lamelle et monté sur la platine du microscope équipé d&#39;une chambre de cellules vivantes, contrôlée à 37 ° C, avec 5% de CO 2, et humidifié. Lors de ces expériences images ont été prises de chaque cluster toutes les 3 minutes pour 400 minutes. Pendant une période de 400 minutes, nous avons observé la dissipation du potentiel de membrane mitochondriale dans NIT-1 grappes cellule où AI4 cellules T ont été attachés. Dans l&#39;expérience, où le contrôle simultané NIT-1 cellules ont été co-cultivées avec CMH dépareillés humaine cellules Jurkat lymphocytes, le potentiel de membrane mitochondriale est resté intact. Cette technique peut être utilisée pour observer en temps réel des changements dans le potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules de l&#39;attaque des lymphocytes cytotoxiques, des cytokines, ou d&#39;autres réactifs cytotoxiques.

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d&#39;imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

methods-to-assess-beta-cell-death-mediated-by-cytotoxic-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.3K vues.  University of Florida. À médiation cellulaire lymphocytotoxicité (LMC) dosages peuvent être utilisés pour tester les réponses autoréactifs et étudier les mécanismes de mort cellulaire in vitro. Cependant, en utilisant des cellules vivantes techniques d'imagerie microscopique confocale avec des colorants fluorescents, le type et la cinétique de la mort cellulaire ainsi que les voies utilisées peuvent être étudiés plus en détail.

Vidéo: Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

L&#39;expansion des lymphocytes T cytotoxiques à partir de sang de cordon ombilical qui cytomégalovirus cible, le virus Epstein-Barr Virus et Adénovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Recherche

Immunologie et infection

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

Détermination de l&#39;activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l&#39;égard des lymphocytes T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on extracellular matrix proteins, for measuring the motility of fluorescently-labeled, non-adherent human or murine effector immune cells. This technique employs a stainless steel manifold and 10-well Teflon slide to focally deposit non-adherent T cells into wells prepared with either confluent tumor cell monolayers or extracellular matrix proteins. Light and/or multi-channel fluorescence microscopy is used to track the movement and behavior of the effector cells over time. Fluorescent dyes and/or viral vectors that code for fluorescent transgenes are used to differentially label the cell types for imaging. This method is distinct from similar-type in vitro assays that track horizontal or vertical migration/invasion utilizing slide chambers, agar or transwell plates. The assay allows detailed imaging data to be collected with different cell types distinguished by specific fluorescent markers; even specific subpopulations of cells (i.e., transduced/nontransduced) can be monitored. Surface intensity fluorescence plots are generated using specific fluorescence channels that correspond to the migrating cell type. This allows for better visualization of the non-adherent immune cell mobility at specific times. It is possible to gather evidence of other effector cell functions, such as cytotoxicity or transfer of viral vectors from effector to target cells, as well. Thus, the method allows researchers to microscopically document cell-to-cell interactions of differentially-labeled, non-adherent with adherent cells of various types. Such information may be especially relevant in the assessment of biologically-manipulated or activated immune cell types, where visual proof of functionality is desired with tumor target cells before their use for cancer therapy.

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusion moléculaire Membranes plasmatiques de Lymphocytes primaires mesurées par Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Quantification rapide de blastogenesis mitogene induite dans les lymphocytes T pour l&#39;identification des médicaments immunomodulateurs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is caused by the fungal pathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), which infects and disrupts frog epidermis; however, pathological changes have not been explicitly characterized. Apoptosis (programmed cell death) can be used by pathogens to damage host tissue, but can also be a host mechanism of disease resistance for pathogen removal. In this study, we quantify epidermal cell death of infected and uninfected animals using two different assays: terminal transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL), and caspase 3/7. Using ventral, dorsal, and thigh skin tissue in the TUNEL assay, we observe cell death in the epidermal cells in situ of clinically infected animals and compare cell death with uninfected animals using fluorescent microscopy. In order to determine how apoptosis levels in the epidermis change over the course of infection we remove toe-tip samples fortnightly over an 8-week period, and use a caspase 3/7 assay with extracted proteins to quantify activity within the samples. We then correlate caspase 3/7 activity with infection load. The TUNEL assay is useful for localization of cell death in situ, but is expensive and time intensive per sample. The caspase 3/7 assay is efficient for large sample sizes and time course experiments. However, because frog toe tip biopsies are small there is limited extract available for sample standardization via protein quantification methods, such as the Bradford assay. Therefore, we suggest estimating skin surface area through photographic analysis of toe biopsies to avoid consuming extracts during sample standardization.

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

We quantify epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis using two methods. First, we use terminal transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL) in situ histology to determine differences between clinically infected and uninfected animals. Second, we conduct a time series analysis of apoptosis over infection using a caspase 3/7 protein analysis.

À l’aide de Terminal Transferase-mediated dUTP Nick fin-étiquetage (TUNEL) et la Caspase 3/7 Assays à mesure la mort cellulaire épidermique chez les grenouilles avec chytridiomycose

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...