我々は、心から豊かな貴重なフィードバックをITS2グループ、バイオセンター、ヴュルツブルク大学、感謝します。資金調達のために、我々はまた、ドイツ学術振興（助成Mu-2831/1-1 DFG）に感謝。

1。 ITS2配列の正しい注釈<ol><li>ここITS2データベース系統のワークベンチにアクセス<a href="http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de" target="_blank">http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.deを</a> </li><li>セクションにある &quot;注釈&quot;アイコンをクリックして、分析を開始する &quot;ツール&quot;をその後、ウェブサイトの上部にあるシーケンスエディタにシーケンスを入力するか貼​​り付けます。シーケンスエディタは自動的にあなたのITS2配列が有効であるかどうか、チェックします。 </li><li>あなたのシーケンスに適したHMMモデル（植物例えば緑色植物亜界）を選択します。 </li><li>クリックしてプロセスを開始し、 &quot;注釈&quot;を</li><li> &quot;ハイブリダイズ&quot;のアイコン上にマウスを移動することで、HMMアノテーションの精度の確認として、5.8Sおよび28S rRNAハイブリッドのイメージを表示することができます。 </li><li>二次構造予測のあなたの方法を選択して、結果ITS2配列の緑色のプラス記号をクリックしてください。知られているtemplatなく、構造を予測するeは、をクリックして &quot;構造を予測します。&quot;あなたはホモロジーモデリングするための独自のテンプレートを使用する場合は、 &quot;モデルの構造&quot;をクリックします。 </li></ol> 2。二次構造予測<ol><li>予測する<ol><li>注釈付きのITS2シーケンスは自動的にシーケンスエディタに貼り付けられます。 </li><li>デフォルトの設定で二次構造予測を開始するには、 &quot;構造を予測する&quot;ボタンをクリックしてください。 </li><li>緑色のプラス記号をクリックして、データ·プールにモデル化された二次構造を含む結果ITS2シーケンスを保存してから、 &quot;プールに追加します。&quot;また、ドラッグアンドドロップ（図1）を介してデータプールに追加することができます。 </li><li>シーケンスを直接折り畳むことができなかった場合は、ホモロジーモデリングの最良の結果が表示されます。ドラッグ·アンド·データ·プールへのドロップで最も適した配列構造を保存します。また、をクリックし、右クリックでデータ·プールに配列構造を保存し、 &quot;プールに追加します。&quot; </li></ol></li><li>カスタムモデル<ol><li>タイプまたはペースト上位シーケンスエディタに1つまたは複数のテンプレート（既知の構造を持つ）。 </li><li>型または低いシーケンスエディタにつまたは複数の標的配列（構造体なし）貼り付けます。 </li><li>デフォルトの設定でホモロジーモデリングを開始するには、 &quot;最善のテンプレート（s）を予測する&quot;をクリックしてください。 </li><li>最高のテンプレートとターゲットの組み合わせは、結果リストに表示されます。 </li><li>ドラッグ·アンド·データ·プールへのドロップを介して、または右クリックし、をクリックすることにより、どちらかお好みのモデル化されたシーケンス構造（s）を保存する &quot;プールに追加します。&quot; </li></ol></li></ol> 3。モチーフ検索<ol><li>ウェブサイトの上部にあるシーケンスエディタにあなたのクエリシーケンス（複数可）を入力するか貼​​り付けます。 </li><li>正しいHMMモデル（植物例えば緑色植物亜界）を選択します。 3.3。プロセスを開始するには、 &quot;モチーフ検索&quot;をクリックします。 </li><li>強調表示されたモチーフとITS2の配列はillustraです。ウェブサイトの下部にあるテッド。 </li><li>二次構造で強調表示されたモチーフを表示するには、シーケンスヘッダの横にあるアイコンをクリックします。 </li></ol> 4。検索とブラウズ<ol><li>検索<ol><li>タイプ分類群名またはウェブサイトの上部にある検索フィールドにGenBankの識別子（GI）のいずれかです。 </li><li>分類群名による検索が表示されるライブ検索ボックスでサポートされています。 </li><li>あなたのクエリをカンマで区切って複数の検索を実行することができます。 </li><li>検索を実行するには、 &quot;検索&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>あなたの結果は新しいタブに表示されて表示されます。 </li><li>特定の列に従って結果をソートする列名をクリックします。また、列メニューでお好みの列を追加または削除することができます。列メニューが列名内で表示される矢印アイコンをクリックするだけで入力することができます。 </li><li>配列構造の詳細を表示するには、 &quot;詳細表示&quot;をクリックします。 &lt;/ LI&gt; <li>ドラッグ·アンド·データ·プールへのドロップを介して、または右クリックし、をクリックすることにより、どちらかお好みの配列構造（s）を保存する &quot;プールに追加します。&quot; </li><li>外部ファイルに結果を保存するには、 &quot;選択範囲を保存&quot;またはをクリックして &quot;すべてを保存します。&quot; </li></ol></li><li>ブラウズ<ol><li>ウェブサイトの左側にツリー状の構造をナビゲートすることによりITS2データベースを閲覧しています。 </li><li> 1つ下のレベルに分類を表示するには、プラス記号をクリックします。 </li><li>分類群のそれぞれの配列構造を含む新しいタブを開くには、分類群名をクリックしてください。 </li><li>シーケンス構造のペアの詳細を表示するには、 &quot;詳細表示&quot;をクリックします。 </li><li>ドラッグ·アンド·データ·プールへのドロップを介して、または右クリックし、をクリックすることにより、どちらかお好みの配列構造（s）を保存する &quot;プールに追加します。&quot; </li><li>外部ファイルに結果を保存するには、 &quot;選択範囲を保存&quot;またはをクリックして &quot;すべてを保存します。&quot; </li></ol></li></ol> 5。 ITS2ブラスト<ol><li>型またはシーケンスエディタにつまたは複数のクエリシーケンスを貼り付けます。あなたのシーケンスは、プレーンのヌクレオチド配列または配列構造体のペアがあります。また、一つの配列の下にいくつかの二次構造を入力することができます。チェックボックスをオンにして、これらの構造は、その後、個々のクエリとして使用される &quot;XXFASTAシーケンスをシリアル化&quot;。 </li><li>デフォルト設定を使用してBLASTを起動するには、をクリックし、 &quot;ブラスト&quot;。一般的なBLASTNまたはITS2の配列構造のBLASTのいずれか、クエリの性質に応じて、実行されます。 </li><li>サブタブが表示されるタブの &quot;BLASTの結果、&quot;同様に実行される検索の概要内の各クエリのシーケンス用に開かれます。 </li><li>計算されたBLASTアラインメントを表示するには、 &quot;表示アラインメント&quot;をクリックします。 </li><li>ドラッグ·アンド·データ·プールへのドロップを介して、または右クリックし、をクリックすることにより、どちらかお好みのBLASTヒットを保存する &quot;プールに追加します。&quot; </li><li>外部ファイルに結果を保存するには、 &quot;保存の選択をクリックしてください&quot;または&quot;すべてを保存します。 &quot; </li></ol> 6。複数のシーケンス構造アライメント<ol><li>右横にプール内のシーケンス番号に &quot;データセットの管理&quot;をクリックして、データプールを見て、その後虫眼鏡のシンボル。また、ウェブサイトの左下にあるデータプール記号をクリックすることができます。 </li><li>その詳細を表示するには、データプール内のシーケンス構造のペアをクリックします。 </li><li>あなたのプール内のすべての配列構造のペアを複数の配列構造体のアラインメントを作成し、次に &quot;データ分析&quot;をクリックして &quot;シーケンス＆構造&quot; </li><li>今、あなたはあなたのアライメントのグラフィックモードを選択するよう求められます。あなたのアラインメントはわずかシーケンスが含まれている場合は、 &quot;いいえ&quot;をクリックして、スリムモードを断るそうでなければクリックして、スリムなグラフィックモードを選択して &quot;はい。&quot; </li><li>しばらくすると、あなたのアラインメントは、新しいタブ（図2）に示されています。また、それは自動的にデータ·プールに保存されます。 </li><li>自分を保存するには外部ファイルの配置は、 &quot;配置を保存します&quot;をクリックしてください</li></ol> 7。系統樹<ol><li>あなたのマルチプルアライメントのツリーを結合する配列構造ベースの隣人を計算するには、 &quot;分析データセット&quot;をクリックし、 &quot;隣人への参加。&quot; </li><li>結果ツリーは、新しいタブ（図3）に示されています。 </li><li>スクロールバーで自由にツリーを拡張する &quot;ズーム木。&quot; </li><li> Rerootノードまたはツリーの葉の上にクリックしてからしてツリー &quot;このノードでReroot。&quot; </li><li>あなたはデータプールからの分類群を削除する場合は、葉の上にクリックして &quot;プールからこのノードを削除します。&quot;今、あなたは、還元分類群のサンプリングと再計算して配置し、ツリーをすることができます。 </li><li>外部NEWICKファイルへの分析の最終結果として系統樹を保存する &quot;保存木&quot;をクリックします。 </li></ol> 8。その他のソフトウェア<ol><li>お知らせの追加を見つけるための &quot;ツール&quot; - &quot;このウェブサイトについて&quot;をクリックしてくださいスタンドアロンツール4SALEとProfDistS約ation。 </li><li>アライメントとITS2のデータベースのWebインタフェースで提供される近隣結合機能のほかに、あなたは今、いくつかの新しい機能が、代償ベースの変更（CBCs）に基づいて、例えば、種の区切りにアクセスできます。 </li></ol> 9。代表的な結果上記のようにワークフローが正常にいくつかのオープンアクセスの調査3,4に適用されている。例は以下のリンクを介して表示することができます。 <ul><li> <a href="http://www.plosone.org/article/info%3Adoi/10.1371/journal.pone.0016931" target="_blank">http://www.plosone.org/article/info％3Adoi％の2F10.1371％2Fjournal.pone.0016931</a> </li><li> <a href="http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/320" target="_blank">http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/320</a> </li></ul>これらの大規模研究で、我々は緑藻の系統と同様にHypnales（コケ植物門）Wを解決することができましたi番目の高解像度。両方のケースでは、網羅的な分類群のサンプリングは、自動的に4SALE 15,16に沿ったITS2データベース9から収集され、最後に系統樹にProfDistS 17によって処理されます。これらすべての手順では、配列と構造情報が同時に使用されました。系統バックボーンのためのブートストラップのサポートはProfDistSのスタンドアロンバージョンで使用可能なプロファイルの近隣への参加（PNJ）19を使用して達成された。 分類群のサンプリングは、複数の配列構造体のアラインメント、最終的には系統樹の計算：配列構造のペアの小さいセットについては、図1から3は、直接新しいITS2データベース·ワークベンチでは、この自動化されたワークフロー5の主要な手順を説明します。 <img src="/files/ftp_upload/3806/3806fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：ドラッグアンドドロップごとに分類群のサンプリング。任意の時間シーケンスまたはシーケンスstructurで<html> eのペアは、ドラッグアンドドロップを介して、例えば、データプールに追加することができます。ここで、配列構造は、二次構造予測の後にドラッグアンドドロップを使用して追加されます。青い楕円は、配列構造は、データプールにドロップされたエリアをマークします。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3806/3806fig1large.jpg" target="_blank">この画像のフルサイズバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> <img src="/files/ftp_upload/3806/3806fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：フルグラフィックモードでの複数の配列構造体のアラインメント。データプール内のいくつかのシーケンスの場合、フルグラフィックモードが選ばれました。塩基としては、着色されている。塩基対は、一塩基または塩基対のブラケットをクリックして、赤丸で強調表示することができます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3806/3806fig2large.jpg" target="_blank">この画像のフルサイズバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 3.JPGの &quot;alt =&quot;図3 &quot;/&gt; 図3シーケンス構造の近隣には、ツリーに参加する。 7分類群に複数の配列構造体のアライメントの計算された自由に拡張可能なツリーがNEWICK形式で保存することができます。

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	<li>Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Including+RNA+secondary+structures+improves+accuracy+and+robustness+in+reconstruction+of+phylogenetic+trees.">Including RNA secondary structures improves accuracy and robustness in reconstruction of phylogenetic trees.</a> Biology Direct. 5, 4-4 (2010).</li><li>Schultz, J., Maisel, S., Gerlach, D., M&#252;ller, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+core+of+secondary+structure+of+the+internal+transcribed+spacer+2+&#40;ITS2&#41;+throughout+the+Eukaryota.">A common core of secondary structure of the internal transcribed spacer 2 &#40;ITS2&#41; throughout the Eukaryota.</a> RNA. 11, 361-364 (2005).</li><li>Buchheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Transcribed+Spacer+2+(nu+ITS2+rRNA)+Sequence-Structure+Phylogenetics:+Towards+an+Automated+Reconstruction+of+the+Green+Algal+Tree+of+Life.">Internal Transcribed Spacer 2 (nu ITS2 rRNA) Sequence-Structure Phylogenetics: Towards an Automated Reconstruction of the Green Algal Tree of Life.</a> PLoS ONE. 6, 16931-16931 (2011).</li><li>Merget, B., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+phylogeny+of+Hypnales+(Bryophyta)+inferred+from+ITS2+sequence-structure+data.">A molecular phylogeny of Hypnales (Bryophyta) inferred from ITS2 sequence-structure data.</a> BMC Research Notes. 3, (2010).</li><li>Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" 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modeling revealed more than 20,000 rRNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) secondary structures.</a> RNA. 11, 1616-1623 (2005).</li><li>Altschul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Seibel, P., M&#252;ller, T., Dandekar, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+visual+analysis+and+editing+of+RNA+sequence+and+secondary+structure+alignments+using+4+SALE.">Synchronous visual analysis and editing of RNA sequence and secondary structure alignments using 4 SALE.</a> BMC Research Notes. 1, (2008).</li><li>Seibel, P., M&#252;ller, T., Dandekar, T., Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+SALE+-+A+tool+for+synchronous+RNA+sequence+and+secondary+structure+alignment+and+editing.">4 SALE - A tool for synchronous RNA sequence and secondary structure alignment and editing.</a> BMC Bioinformatics. 7, (2006).</li><li>Wolf, M., Ruderisch, B., Dandekar, T., Schultz, J., M&#252;ller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProfDistS:(profile-)+distance+based+phylogeny+on+sequence-structure+alignments.">ProfDistS:(profile-) distance based phylogeny on sequence-structure alignments.</a> Bioinformatics. 24, 2401-2402 (2008).</li><li>Saitou, N., Nei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neighbor-joining+method:+a+new+method+for+reconstructing+phylogenetic+trees.">The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.</a> Molecular Biology and Evolution. 4, 406-425 (1987).</li><li>M&#252;ller, T., Rahmann, S., Dandekar, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+robust+phylogeny+estimation+based+on+profile+distances:+a+study+of+the+Chlorophyceae+(Chlorophyta.">Accurate and robust phylogeny estimation based on profile distances: a study of the Chlorophyceae (Chlorophyta.</a> BMC Evolutionary Biology. 4, (2004).</li><li>Ludwig, W. o. l. f. g. a. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARB:+a+software+environment+for+sequence+data.">ARB: a software environment for sequence data.</a> Nucleic Acids Research. 32, 1363-1371 (2004).</li><li>Néron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobyle:+a+new+full+web+bioinformatics+framework.">Mobyle: a new full web bioinformatics framework.</a> Bioinformatics. 25, 3005-3011 (2009).</li><li>Camin, J. H., Sokal, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+deducing+branching+sequences+in+phylogeny.">A method for deducing branching sequences in phylogeny.</a> Evolution. 19, 311-326 (1965).</li><li>Felsenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trees+from+DNA+sequences:+a+maximum+likelihood+approach.">Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach.</a> Journal of Molecular Evolution. 17, 368-376 (1981).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ITS2データベースは、内部転写スペーサ2配列構造に基づく系統学のための完全な、完全に機能ベンチです。ウェブサイトは非常に高速かつ直感的に操作することができます。 ARB 20またはMobyle 21のような他のウェブベースの系統のベンチだけ配列および/ ​​またはコンセンサス構造情報上で動作することができますが、ITS2データベース9は、同時にそれぞれの分類群のための配列と個人の二次構造を考慮します。ただし、Webサーバの計算能力に制限があるため、それは非常に大規模なデータセットについて、それぞれ4SALE 15,16とProfDistS 17、18の計算に参加する複数のアラインメントと近隣のスタンドアロンツールを使用することをお勧めします。基本的なITS2の配列構造の系統ワークフロー5の横に、これらのツールは、ブートストラップ複製さを計算するように、（PNJ）19または正貨に参加プロファイル近隣のいくつかの追加機能を備えていますの区切りは代償ベースの変更（CBCs 8）に基づいています。ダウンロードおよび詳細については、 &quot;ツール&quot;セクション - 彼らは &quot;このサイトについて&quot;を介してアクセスすることができます。 4SALEとProfDistSを使用するには、常に正しい形式にファイルを持参する必要があります。 4SALEで処理されるようにサンプリング分類群は、結末を持っている必要があります。FASTAまたはTXT、ProfDistSの入力として配列構造体のアラインメント一方。xfastaで終了する必要があります。 我々は現在、ITS2データベースなどの関連ツールでの系統樹の再構築のための代替メソッドを実装している。したがって、配列構造をベースに最大節約22および/ ​​または最大尤度23のようなメソッドは、将来的にアクセスできるようになります。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>インターネットアクセス</td><td></td><td>好ましくは、高速</td></tr><tr><td> ITS2データベース9 </td><td>バイオインフォマティクスの部門、ヴュルツブルク大学</td><td>ウェブサイト： <a href="http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de" target="_blank">http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de</a> </td></tr><tr><td>ソフトウェア：4SALE 15,16 </td><td>バイオインフォマティクスの部門、ヴュルツブルク大学</td><td>ダウンロード： <a href="http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/" target="_blank">http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/</a> </td></tr><tr><td>ソフトウェア：ProfDistS 17 </td><td>バイオインフォマティクスの部門、ヴュルツブルク大学</td><td>ダウンロード：NI-wuerzburg.de / &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://profdist.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/ </td></tr></tbody></table>

the its2 database

内部転写スペーサー2（ITS2）は二十年以上のための系統マーカーとして使用されています。 ITS2の研究は主に非常に可変ITS2シーケンスに焦点を当てたとして、それだけで低レベルの系統学にこのマーカーを閉じ込めた。しかし、ITS2配列とその高度に保存された二次構造の組み合わせは、分解能1系統を向上させ、種の区切り2月8日を含む複数の分類学上のランクで系統推定することができます。 ITS2データベース9は、正確にreannotated NCBI GenBankの11 10から内部転写スペーサー2配列の網羅的なデータセットを示します。プロファイル隠れマルコフモデル（HMM）による注釈に続いて、各配列の二次構造が予測されています。最初に、それは正しい、4つのらせんコンフォメーション倍に12に基づいて最小エネルギー（直接倍）が結果かどうかをテストされています。このようなケースでない場合は、構造がホモロジーモデリング13で予測した。ホモロジーモデリングでは、既に知られている二次構造は、別のITS2の配列に転送され、その二次構造は、ダイレクト倍で正しく折り畳むことができませんでした。 ITS2データベースは、ストレージ用にデータベースおよびITS2配列構造の検索だけではありません。また、注釈、構造予測、モチーフ検出と組み合わせた配列の構造情報のBLAST 14検索を含む、独自のITS2の配列を処理するためにいくつかのツールを提供しています。また、4SALE 15,16のトリミングされたバージョンを統合し、複数の配列構造体のアライメントの計算、18木の再建に参加する隣人のために17 ProfDistS。彼らは一緒に配列と二次構造に基づいて、系統への配列の最初のセットから一貫した解析パイプラインを形成します。 一言で言えば、このワークベンチは、最初の系統解析を簡素化数回のマウスクリック、さらに包括的な大規模解析のためのツールやデータを提供している。

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The ITS2 Database

ITS2のデータベースを同時に配列と内部転写スペーサ2の二次構造を考慮した系統推定のためのワークベンチです。これは正確な注釈、構造予測、複数の配列構造体のアライメントと高速ツリーの計算とデータ収集が含まれています。一言で言えば、このワークベンチは、数回のクリックに最初の系統解析を簡素化します。

ITS2データベース

The internal transcribed spacer 2 (ITS2) has been used as a phylogenetic marker for more than two decades.  As ITS2 research mainly focused on the very ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.4K ビュー.  University of Würzburg. ITS2のデータベースを同時に配列と内部転写スペーサ2の二次構造を考慮した系統推定のためのワークベンチです。これは正確な注釈、構造予測、複数の配列構造体のアライメントと高速ツリーの計算とデータ収集が含まれています。一言で言えば、このワークベンチは、数回のクリックに最初の系統解析を簡素化します。

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Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

胚性幹細胞を生体内でクロマチン蛋白質のダイナミクスを測定するアッセイ（FRAP＆FLIP）を光退色

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

生物学

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

新生児肝外胆管細胞を単離する

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

MALDI-TOF質量分析およびカスタムデータベースを使用すると、ユニークな洞窟環境（カーチェナー洞窟、AZ、USA）を常在菌を特徴づけるために

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

可視化と系統特異的マーカーと間葉系細胞脂肪細胞の微分の潜在性の定量化

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI質量分析イメージングを用いた代謝プロファイリングのサンプル調製

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...