Wir bedanken uns herzlich die ITS2 Gruppe, Biozentrum, Universität Würzburg, für die Reichen und wertvolles Feedback. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; Zuschuss Mu-2831/1-1) für die Finanzierung.

1. Korrekte Annotation von ITS2 Sequence <ol><li> Besuchen Sie das ITS2 Database Workbench Phylogenie hier: <a href="http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de" target="_blank">http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de</a> </li><li> Beginnen Sie Ihre Analyse über die Schaltfläche &quot;Kommentieren&quot;-Symbol in der Sektion &quot;Tools&quot;. Dann geben oder fügen Sie Ihre Sequenz in die Sequenz-Editor am oberen Rand der Website. Der Sequenz-Editor prüft automatisch, ob Ihr ITS2 Sequenzen gültig sind. </li><li> Wählen Sie ein HMM-Modell eignet sich für Ihre Sequenzen (zB Viridiplantae für Pflanzen). </li><li> Starten Sie den Vorgang durch Klicken auf &quot;Kommentieren&quot;. </li><li> Durch Überfahren des &quot;hybridisieren&quot;-Symbol können Sie ein Bild des 5.8S und 28S-rRNA-Hybrid als eine Bestätigung der HMM-Annotation die Genauigkeit anzuzeigen. </li><li> Klicken Sie auf das grüne Pluszeichen des resultierenden ITS2 Sequenz auf dem Weg der Sekundärstruktur Vorhersage wählen: Um die Struktur ohne eine bekannte templat vorhersagene, klicken Sie auf &quot;Predict Struktur.&quot; Wenn Sie eine eigene Vorlage für die Homologiemodellierung verwenden möchten, klicken Sie auf &quot;Modell-Struktur.&quot; </li></ol> 2. Sekundärstruktur Vorhersage <ol><li> Vorhersagen <ol><li> Die kommentierte ITS2 Sequenz wird automatisch in die Sequenz-Editor eingefügt. </li><li> Um die Sekundärstruktur Vorhersage mit den Standardeinstellungen zu starten, klicken Sie auf die &quot;Predict Strukturen&quot;-Taste. </li><li> Speichern Sie die resultierende Sequenz ITS2 einschließlich der modellierten sekundären Struktur in den Datenpool, indem Sie auf das grüne Plus-Zeichen und dann auf &quot;Hinzufügen zu bündeln.&quot; Alternativ können Sie es auf Ihre Daten Pool hinzufügen per Drag and Drop (Abbildung 1). </li><li> Wenn die Sequenz konnte nicht direkt aussteigen, werden die besten Ergebnisse der Homologie-Modellierung gezeigt. Speichern Sie die am besten geeignete Sequenz-Struktur per Drag &amp; Drop auf den Datenpool. Alternativ speichern Sie die Sequenz-Struktur in den Daten-Pool mit einem Rechtsklick und dann ein Klick auf &quot;In den Pool.&quot; </li></ol></li><li> Benutzerdefinierte Modeling <ol><li> Geben oder fügen Sie eine oder mehrere Vorlagen (mit bekannter Struktur) in die obere Sequenz-Editor. </li><li> Geben oder fügen Sie ein oder mehrere Zielsequenzen (ohne Struktur) in die untere Sequenz-Editor. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Predict beste Vorlage (n)&quot;, um die Homologiemodellierung mit den Standardeinstellungen zu starten. </li><li> Die besten Template-Target-Kombinationen sind in der resultierenden Liste angezeigt. </li><li> Speichern Sie die modellierten Sequenz-Struktur (en) Ihrer Wahl entweder per Drag &amp; Drop auf den Datenpool oder durch einen Rechtsklick und einem Klick auf &quot;In den Pool.&quot; </li></ol></li></ol> 3. Motif-Suche <ol><li> Geben oder fügen Sie Ihre Anfrage Sequenz (en) in die Sequenz-Editor am oberen Rand der Website. </li><li> Wählen Sie die richtige HMM-Modell (zB Viridiplantae für Pflanzen). 3.3. Klicken Sie auf &quot;Motivsuche&quot;, um den Vorgang zu starten. </li><li> ITS2 Sequenzen mit hervorgehobenen Motive sind AbbildungenTed am unteren Rand der Webseite. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol neben der Sequenz-Header, um die Motive in der Sekundärstruktur hervorgehoben angezeigt wird. </li></ol> 4. Suchen und Stöbern <ol><li> Suche <ol><li> Geben Sie entweder ein Name oder ein Taxon GenBank Identifier (GI) in das Suchfeld am oberen Rand der Website. </li><li> Eine Suche nach Taxon Name wird von einem erscheinende Live-Suchfeld unterstützt. </li><li> Sie können eine mehrere Suchbegriffe durch Kommata getrennt Ihre Fragen. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Suchen&quot;, um die Suche auszuführen. </li><li> Ihre Ergebnisse erscheinen in einem neuen Tab angezeigt. </li><li> Klicken Sie auf einen Spaltennamen, um die Ergebnisse entsprechend der jeweiligen Spalte zu sortieren. Sie können auch Spalten hinzufügen oder entfernen Ihrer Wahl mit der Spalte Menü. Die Spalte-Menü kann mit einem Klick auf das Pfeil-Icon erscheint innerhalb einer Spalte Name eingegeben werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Details anzeigen&quot;, um die Details einer Sequenz-Struktur zu sehen. &lt;/ Li&gt; <li> Speichern Sie die Sequenz-Struktur (en) Ihrer Wahl entweder per Drag &amp; Drop auf den Datenpool oder durch einen Rechtsklick und einem Klick auf &quot;In den Pool.&quot; </li><li> Um Ihre Ergebnisse in eine externe Datei zu speichern, dann auf &quot;Speichern Auswahl&quot; oder klicken Sie auf &quot;Save all&quot;. </li></ol></li><li> Blättern <ol><li> Durchsuchen Sie die Datenbank ITS2 durch das Navigieren durch die Baumstruktur auf der linken Seite der Website. </li><li> Klicken Sie auf ein Pluszeichen, um die Taxa eine Ebene tiefer zu sehen. </li><li> Klicken Sie auf ein Taxon-Namen, um eine neue Registerkarte mit jeder Sequenz-Struktur des Taxons zu öffnen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Details anzeigen&quot;, um die Details einer Sequenz-Struktur-Paar zu sehen. </li><li> Speichern Sie die Sequenz-Struktur (en) Ihrer Wahl entweder per Drag &amp; Drop auf den Datenpool oder durch einen Rechtsklick und einem Klick auf &quot;In den Pool.&quot; </li><li> Um Ihre Ergebnisse in eine externe Datei zu speichern, dann auf &quot;Speichern Auswahl&quot; oder klicken Sie auf &quot;Save all&quot;. </li></ol></li></ol> 5. ITS2 Explosion<ol><li> Geben oder fügen Sie ein oder mehrere Abfrage-Sequenzen in die Sequenz-Editor. Ihre Sequenzen können entweder einfache Nukleotid-Sequenzen oder Sequenz-Struktur-Paaren sein. Sie können auch mehrere sekundäre Strukturen unterhalb einer Sequenz. Indem Sie das Kontrollkästchen &quot;Serialize XXFASTA Sequenzen&quot; diese Strukturen anschließend als einzelne Abfragen verwendet werden. </li><li> Um BLAST mit den Standardeinstellungen zu starten, klicken Sie auf &quot;Blast.&quot; Je nach Art der Abfrage, entweder eine gemeinsame BLASTN oder die ITS2-Sequenz-Struktur BLAST durchgeführt wird. </li><li> Ein Sub-Register wird für jede Abfrage-Sequenz innerhalb der erscheinenden Registerkarte geöffnet &quot;BLAST-Ergebnisse&quot;, sowie einen Überblick über die ausgeführten Recherchen. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Show Alignments&quot;, um die berechneten BLAST Ausrichtungen anzuzeigen. </li><li> Speichern Sie die BLAST-Hits Ihrer Wahl entweder per Drag &amp; Drop auf den Datenpool oder durch einen Rechtsklick und einem Klick auf &quot;In den Pool.&quot; </li><li> Um Ihre Ergebnisse in eine externe Datei zu speichern, auf &quot;Speichern Auswahl klicken&quot;Oder&quot; Alle speichern. &quot; </li></ol> 6. Multiple Sequenz-Struktur-Alignment <ol><li> Werfen Sie einen Blick auf Ihre Datenpool durch Klick auf &quot;Verwalten Datensatz&quot; und dann das Lupensymbol rechts neben der Anzahl der Sequenzen in Ihrem Pool. Alternativ können Sie auch auf dem Daten-Pool Zeichen am unteren Rand der Website links klicken. </li><li> Klicken Sie auf eine Sequenz-Struktur-Paar in den Daten-Pool, um dessen Details anzuzeigen. </li><li> Um eine mehrfache Sequenz-Struktur-Ausrichtung aller Sequenz-Struktur-Paare in Ihrem Pool zu erstellen, auf &quot;Analyze Datensatz&quot; klicken und dann &quot;Sequenz und Struktur.&quot; </li><li> Nun werden Sie gefragt, um die Grafik-Modus Ihres Ausrichtung wählen. Wenn Ihre Ausrichtung enthält nur wenige Sequenzen, sinken die schlanke Modus, indem Sie auf &quot;Nein!&quot; Andernfalls wählen Sie die schlanken grafischen Modus, indem Sie auf &quot;Ja.&quot; </li><li> In wenigen Augenblicken ist Ihre Ausrichtung in einem neuen Tab (Abbildung 2) gezeigt. Darüber hinaus wird es automatisch auf den Datenpool gespeichert. </li><li> Um Ihre sparenAusrichtung auf eine externe Datei, klicken Sie auf &quot;Speichern Ausrichtung.&quot; </li></ol> 7. Stammbaum <ol><li> Um eine Sequenz-Struktur-basierte Nachbar Joining Baum des multiplen Alignment zu berechnen, auf &quot;Analyze Dataset&quot; klicken und dann &quot;Neighbor Joining&quot;. </li><li> Der resultierende Baum wird in einem neuen Tab (Abbildung 3) dargestellt. </li><li> Skalieren Sie Ihr Baum frei mit der Scroll-Leiste &quot;Zoom Baum.&quot; </li><li> Reroot Ihren Baum mit einem Klick auf einen Knoten oder Blatt des Baumes und dann &quot;Reroot an diesem Knoten.&quot; </li><li> Wenn Sie ein Taxon aus Ihren Daten-Pool entfernen möchten, klicken Sie auf das Blatt, und wählen Sie &quot;Entfernen Sie diesen Knoten aus Pool.&quot; Jetzt können Sie Ihre neu berechnen Alignment und Baum mit dem reduzierten Taxon Probenahme. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speichern Baum&quot;, um Ihren Stammbaum als endgültiges Ergebnis Ihrer Analyse an ein externes NEWICK Datei zu speichern. </li></ol> 8. Zusätzliche Software <ol><li> Klicken Sie auf &quot;Über diese Website&quot; - &quot;Extras&quot; finden Sie weitere informierenation über den Stand-Alone-Tools 4SALE und ProfDistS. </li><li> Neben der Ausrichtung und Neighbor Joining-Funktion durch die ITS2 Database Web-Interface zur Verfügung gestellt haben, können Sie nun Zugriff auf einige neue Funktionen, z. B. Arten Abgrenzung auf kompensatorische Basenänderungen (CBC) basieren. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Der Workflow, wie oben beschrieben wurde erfolgreich in mehreren Open-Access-Befragungen 3,4 angewandt worden. Beispiele können über die folgenden Links eingesehen werden: <ul><li> <a href="http://www.plosone.org/article/info%3Adoi/10.1371/journal.pone.0016931" target="_blank">http://www.plosone.org/article/info% 3Adoi% 2F10.1371% 2Fjournal.pone.0016931</a> </li><li> <a href="http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/320" target="_blank">http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/320</a> </li></ul> In diesen groß angelegte Studien, konnten wir die Phylogenie der Chlorophyta sowie Hypnales (Bryophyta) w lösenit Hochauflösung. In beiden Fällen wurde eine erschöpfende Taxon Probenahme aus der Datenbank ITS2 9, automatisch mit 4SALE 15,16 ausgerichtet gesammelt und schließlich durch ProfDistS 17 in einen phylogenetischen Baum verarbeitet. In all diesen Schritten wurden Sequenz und Struktur Informationen gleichzeitig verwendet. Bootstrap Unterstützung für die phylogenetische Rückgrat wurde durch die Verwendung Profil Nachbar Fügen (NPC) 19, die in der Standalone-Version von ProfDistS ist. Für eine kleinere Gruppe von Sequenz-Struktur-Paare, beschreiben Abbildungen 1 bis 3 die wichtigsten Schritte dieser automatisierten Workflow-5 direkt auf der neuen ITS2 Database Workbench: Taxon Probenahme, die multiples Sequenz-Alignment-Struktur und schließlich die Berechnung phylogenetischer Baum. <img src="/files/ftp_upload/3806/3806fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Taxon Probenahme per Drag and Drop. Zu jeder Zeit können Sequenzen oder Sequenz-structur<html> e-Paare können auf den Datenpool aufgenommen werden, zum Beispiel per Drag and Drop. Hier wird eine Sequenz-Struktur hinzugefügt wird per Drag &amp; Drop nach Sekundärstruktur Vorhersage. Die blaue Ellipse markiert den Bereich, wo die Sequenz-Struktur in den Daten-Pool fallen gelassen wird. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3806/3806fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Full-Size-Version dieses Bildes zu sehen.</a> <img src="/files/ftp_upload/3806/3806fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Multiple Sequenz-Struktur-Ausrichtung in voller Grafik-Modus. Für die wenigen Sequenzen im Datenpool wurde die volle Grafik-Modus gewählt. Basen sind farbig; Basenpaare kann mit roten Kreisen, indem Sie auf ein Basis-oder Halter von einem Basenpaar hervorgehoben werden. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3806/3806fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um die Full-Size-Version dieses Bildes zu sehen.</a> 3.jpg &quot;alt =&quot; Bild 3 &quot;/&gt; Abbildung 3. Sequenz-Struktur-Nachbar-Joining-Baum. Das frei skalierbare Baum von einem sieben Taxa multiples Sequenz-Alignment berechnet Struktur kann in der NEWICK Format gespeichert werden.

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	<li>Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Including+RNA+secondary+structures+improves+accuracy+and+robustness+in+reconstruction+of+phylogenetic+trees.">Including RNA secondary structures improves accuracy and robustness in reconstruction of phylogenetic trees.</a> Biology Direct. 5, 4-4 (2010).</li><li>Schultz, J., Maisel, S., Gerlach, D., M&#252;ller, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+core+of+secondary+structure+of+the+internal+transcribed+spacer+2+&#40;ITS2&#41;+throughout+the+Eukaryota.">A common core of secondary structure of the internal transcribed spacer 2 &#40;ITS2&#41; throughout the Eukaryota.</a> RNA. 11, 361-364 (2005).</li><li>Buchheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Transcribed+Spacer+2+(nu+ITS2+rRNA)+Sequence-Structure+Phylogenetics:+Towards+an+Automated+Reconstruction+of+the+Green+Algal+Tree+of+Life.">Internal Transcribed Spacer 2 (nu ITS2 rRNA) Sequence-Structure Phylogenetics: Towards an Automated Reconstruction of the Green Algal Tree of Life.</a> PLoS ONE. 6, 16931-16931 (2011).</li><li>Merget, B., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+phylogeny+of+Hypnales+(Bryophyta)+inferred+from+ITS2+sequence-structure+data.">A molecular phylogeny of Hypnales (Bryophyta) inferred from ITS2 sequence-structure data.</a> BMC Research Notes. 3, (2010).</li><li>Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITS2+sequence-structure+analysis+in+phylogenetics:+a+how-to+manual+for+molecular+systematics.">ITS2 sequence-structure analysis in phylogenetics: a how-to manual for molecular systematics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 52, 520-523 (2009).</li><li>Coleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITS2+is+a+double-edged+tool+for+eukaryote+evolutionary+comparisons.">ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons.</a> Trends in Genetics. 19, 370-375 (2003).</li><li>Coleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+a+coincidence+between+evolutionary+landmarks+found+in+mating+affinity+and+a+DNA+sequence.">The significance of a coincidence between evolutionary landmarks found in mating affinity and a DNA sequence.</a> Protist. 151, 1-9 (2000).</li><li>M&#252;ller, T., Philippi, N., Dandekar, T., Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+species.">Distinguishing species.</a> RNA. 13, 1469-1472 (2007).</li><li>Koetschan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ITS2+Database+III-sequences+and+structures+for+phylogeny.">The ITS2 Database III-sequences and structures for phylogeny.</a> Nucleic Acids Research. 38, 275-279 (2010).</li><li>Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5.8+S-28S+rRNA+interaction+and+HMM-based+ITS2+annotation.">5.8 S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation.</a> Gene. 430, 50-57 (2009).</li><li>Benson, D., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D., Ostell, J., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 39, 32-37 (2011).</li><li>Markham, N., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization.">Software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-453 (2008).</li><li>Wolf, M., Achtziger, M., Schultz, J., Dandekar, T., M&#252;ller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+modeling+revealed+more+than+20,000+rRNA+internal+transcribed+spacer+2+(ITS2)+secondary+structures.">Homology modeling revealed more than 20,000 rRNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) secondary structures.</a> RNA. 11, 1616-1623 (2005).</li><li>Altschul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Seibel, P., M&#252;ller, T., Dandekar, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+visual+analysis+and+editing+of+RNA+sequence+and+secondary+structure+alignments+using+4+SALE.">Synchronous visual analysis and editing of RNA sequence and secondary structure alignments using 4 SALE.</a> BMC Research Notes. 1, (2008).</li><li>Seibel, P., M&#252;ller, T., Dandekar, T., Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+SALE+-+A+tool+for+synchronous+RNA+sequence+and+secondary+structure+alignment+and+editing.">4 SALE - A tool for synchronous RNA sequence and secondary structure alignment and editing.</a> BMC Bioinformatics. 7, (2006).</li><li>Wolf, M., Ruderisch, B., Dandekar, T., Schultz, J., M&#252;ller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProfDistS:(profile-)+distance+based+phylogeny+on+sequence-structure+alignments.">ProfDistS:(profile-) distance based phylogeny on sequence-structure alignments.</a> Bioinformatics. 24, 2401-2402 (2008).</li><li>Saitou, N., Nei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neighbor-joining+method:+a+new+method+for+reconstructing+phylogenetic+trees.">The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.</a> Molecular Biology and Evolution. 4, 406-425 (1987).</li><li>M&#252;ller, T., Rahmann, S., Dandekar, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+robust+phylogeny+estimation+based+on+profile+distances:+a+study+of+the+Chlorophyceae+(Chlorophyta.">Accurate and robust phylogeny estimation based on profile distances: a study of the Chlorophyceae (Chlorophyta.</a> BMC Evolutionary Biology. 4, (2004).</li><li>Ludwig, W. o. l. f. g. a. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARB:+a+software+environment+for+sequence+data.">ARB: a software environment for sequence data.</a> Nucleic Acids Research. 32, 1363-1371 (2004).</li><li>Néron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobyle:+a+new+full+web+bioinformatics+framework.">Mobyle: a new full web bioinformatics framework.</a> Bioinformatics. 25, 3005-3011 (2009).</li><li>Camin, J. H., Sokal, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+deducing+branching+sequences+in+phylogeny.">A method for deducing branching sequences in phylogeny.</a> Evolution. 19, 311-326 (1965).</li><li>Felsenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trees+from+DNA+sequences:+a+maximum+likelihood+approach.">Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach.</a> Journal of Molecular Evolution. 17, 368-376 (1981).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die ITS2 Database ist ein komplettes und voll funktionsfähiges Werkbank für den internen transkribierten Spacer 2-Sequenz-Struktur-basierte Phylogenetik. Die Website ist sehr schnell und intuitiv zu bedienen. Während andere Web-basierte Phylogenese Werkbänken wie ARB 20 oder Mobyle 21 nur in der Lage, auf Reihenfolge und / oder Informationen Konsensus-Struktur zu arbeiten, hält die ITS2 Datenbank 9 Sequenzen und einzelnen Sekundärstrukturen für jedes Taxon gleichzeitig. Jedoch aufgrund von Einschränkungen in der Rechenkapazität des Web-Servers, ist es sehr empfehlenswert, um die Stand-alone-Werkzeuge für multiple Alignment und Neighbor Joining 18 Berechnung, 4SALE 15,16 ProfDistS und 17, jeweils für große Datenmengen nutzen. Neben der grundlegenden ITS2 Sequenz-Struktur Phylogenie Workflow-5, zeichnen sich diese Werkzeuge an zusätzlichen Funktionen, wie die Berechnung Bootstrap-Wiederholungen, Profil Nachbar Fügen (NPC) 19 oder species Begrenzung auf kompensatorische Basenänderungen (CBC) 8 basiert. Abschnitt &quot;Tools&quot; zum Download und ausführliche Informationen - Sie können durch das &quot;Über diese Website&quot; zugegriffen werden. Um 4SALE und ProfDistS verwenden, ist es notwendig zu bringen immer Dateien in das richtige Format. Ein Taxon von der Probenahme bis 4SALE verarbeitet werden müssen haben die Endung. FASTA oder. Txt, während die Sequenz-Struktur-Ausrichtung als Input für ProfDistS müssen. Xfasta beenden. Wir sind derzeit die Umsetzung alternativer Methoden zur Rekonstruktion phylogenetischer Baum in der ITS2 Datenbank sowie in den zugehörigen Werkzeugen. So werden Methoden wie Sequenz-Struktur-basierte Maximum Parsimony 22 und / oder Maximum Likelihood 23 zugänglich sein, in der Zukunft.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Internetzugang </td><td></td><td> Vorzugsweise High-Speed- </td></tr><tr><td> ITS2 Datenbank 9 </td><td> Lehrstuhl für Bioinformatik, Universität Würzburg </td><td> Webseite: <a href="http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de" target="_blank">http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de</a> </td></tr><tr><td> Software: 4SALE 15,16 </td><td> Lehrstuhl für Bioinformatik, Universität Würzburg </td><td> Download: <a href="http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/" target="_blank">http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/</a> </td></tr><tr><td> Software: ProfDistS 17 </td><td> Lehrstuhl für Bioinformatik, Universität Würzburg </td><td> Herunterladen:NI-wuerzburg.de / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://profdist.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/ </td></tr></tbody></table>

the its2 database

Die internen transkribierten Spacer 2 (ITS 2) wurde als phylogenetischer Marker wurden für mehr als zwei Jahrzehnten eingesetzt. Als ITS2 Forschung vor allem auf die sehr variable ITS2 Sequenz konzentriert, es auf diese Markierung, um Low-Level-Phylogenetik nur beschränkt. Jedoch verbessert die Kombination der ITS2-Sequenz und die hoch konservierten Sekundärstruktur die phylogenetische Auflösung 1 und erlaubt phylogenetischen Folgerung bei mehreren Reihen taxonomische, einschließlich Spezies Abgrenzung 2-8. Die ITS2 Datenbank 9 bilden eine vollständige Datensatz der internen transkribierten Spacer 2 Sequenzen aus NCBI GenBank 11 akkurat reannotated 10. Nach einer Anmerkung durch Profile Hidden Markov Models (HMM), wird die sekundäre Struktur von jeder Sequenz vorhergesagt. Zuerst wird bestimmt, ob eine Mindestenergie bezogen Falz 12 (direkt fach) zu einer korrekten, Vier-Helix-Konformation getestet. Ist dies nicht der Fall ist, ist die Strukturvorhergesagt durch Homologiemodellierung 13. In Homologiemodellierung, ein bereits bekannter Sekundärstruktur zu einem anderen ITS2 Sequenz übertragen wird, war deren sekundäre Struktur nicht in der Lage, korrekt zu falten in einem direkten fache. Die ITS2 Database ist nicht nur eine Datenbank zum Speichern und Abrufen der ITS2-Sequenz-Strukturen. Es bietet auch verschiedene Tools, um Ihre eigene ITS2 Sequenzen, einschließlich Anmerkungen, strukturelle Voraussage, Motiv-Erkennung und 14 BLAST Suche auf der kombinierten Sequenz-Struktur-Informationen zu verarbeiten. Darüber hinaus integriert es getrimmten Versionen von 4SALE 15,16 und 17 für ProfDistS multiples Sequenz-Alignment-Struktur Berechnung und Neighbor Joining 18 Baum Rekonstruktion. Zusammen bilden sie eine kohärente Analyse-Pipeline von einer anfänglichen Menge von Sequenzen zu einer Phylogenie auf Sequenz und der Sekundärstruktur basiert. Auf den Punkt gebracht, erleichtert es das erste Werkbank phylogenetische Analysen auf nurein paar Mausklicks, während zusätzlich die Bereitstellung von Tools und Daten für umfassende groß angelegte Analysen.

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The ITS2 Database

Die ITS2 Datenbank ist eine Werkbank für phylogenetische Schluß gleichzeitiger Berücksichtigung Sequenz und der Sekundärstruktur der internen transkribierten Spacer 2. Dazu gehören die Datenerfassung mit genauen Anmerkungen, die Vorhersage, multiples Sequenz-Alignment-Struktur und schnelle Berechnung Baum. Auf den Punkt gebracht, erleichtert es das erste Werkbank phylogenetische Analysen auf ein paar Klicks.

Die ITS2 Database

The internal transcribed spacer 2 (ITS2) has been used as a phylogenetic marker for more than two decades.  As ITS2 research mainly focused on the very ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.5K Aufrufe.  University of Würzburg. Die ITS2 Datenbank ist eine Werkbank für phylogenetische Schluß gleichzeitiger Berücksichtigung Sequenz und der Sekundärstruktur der internen transkribierten Spacer 2. Dazu gehören die Datenerfassung mit genauen Anmerkungen, die Vorhersage, multiples Sequenz-Alignment-Struktur und schnelle Berechnung Baum. Auf den Punkt gebracht, erleichtert es das erste Werkbank phylogenetische Analysen auf ein paar Klicks.

Serie: The ITS2 Database

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) zu Chromatin Protein Dynamics in Living embryonalen Stammzellen Measure

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Forschung

Biologie

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Die Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie und einer Kundendatenbank zu den Bakterien Indigene auf eine einzigartige Höhle Umwelt (Kartchner Caverns, AZ, USA) Charakterisieren

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

Visualisierung und Quantifizierung von mesenchymalen Zellen adipogenen Differenzierung Potenzial mit einer Linie spezifische Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Probenvorbereitung für metabolisches Profiling mittels MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...