Le damos una cordial agradecimiento al grupo de ITS2, Biocenter, Universidad de Würzburg, para la retroalimentación rica y valiosa. También agradecemos a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Mu-2831/1-1 subsidio) para su financiación.

1. Anotación correcta de la secuencia ITS2 <ol><li> Acceder a la mesa de trabajo de base de datos ITS2 filogenia aquí: <a href="http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de" target="_blank">http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de</a> </li><li> Comience su análisis haciendo clic en el &quot;Anotar&quot; icono en la sección &quot;Herramientas&quot;. A continuación, escriba o pegue la secuencia en el editor de secuencias en la parte superior de la página web. El editor de secuencia comprueba automáticamente si sus secuencias ITS2 son válidos. </li><li> Elija un modelo HMM adecuada para sus secuencias (por ejemplo, Viridiplantae para las plantas). </li><li> Iniciar el proceso haciendo clic en &quot;Anotar&quot;. </li><li> Al pasar por la &quot;hibridizar&quot; icono puede ver una imagen de la 5.8S y 28S rRNA híbrida como una confirmación de la exactitud de la anotación del HMM. </li><li> Haga clic en el signo más verde resultante de la secuencia ITS2 para seleccionar el modo de predicción de estructura secundaria: Para predecir la estructura sin templat conocidacorreo, haga clic en &quot;Predecir la estructura.&quot; Si desea utilizar su propia plantilla para el modelado de homología, haga clic en &quot;La estructura del modelo.&quot; </li></ol> 2. Predicción de estructura secundaria <ol><li> Predecir <ol><li> La secuencia ITS2 anotada automáticamente pegar en el editor de secuencias. </li><li> Para iniciar la predicción de estructura secundaria con la configuración predeterminada, haga clic en el &quot;predecir las estructuras de&quot; botón. </li><li> Guarde la secuencia ITS2 resultado incluyendo la estructura modelada secundaria en el pool de datos haciendo clic en el signo más verde y luego &quot;Añadir a la piscina.&quot; Como alternativa, puede añadirlo a su banco de datos a través de arrastrar y soltar (Figura 1). </li><li> Si la secuencia no podía doblar directamente, los mejores resultados de la homología de modelos se muestran. Guardar la más adecuada secuencia-estructura a través de arrastrar y soltar para el pool de datos. Como alternativa, guarde la secuencia-estructura en el banco de datos con un clic derecho y luego un clic en &quot;Añadir a la piscina.&quot; </li></ol></li><li> Modelado personalizado <ol><li> Introduzca o pegue una o varias plantillas (con la estructura conocida) en el editor de secuencia superior. </li><li> Introduzca o pegue una o varias secuencias diana (sin estructura) en el editor de secuencia inferior. </li><li> Haga clic en &quot;Predecir mejor plantilla (s)&quot; para iniciar el modelado de homología con la configuración predeterminada. </li><li> Las mejores plantillas de destino combinaciones se muestran en la lista resultante. </li><li> Guarde el modelado secuencia-estructura (s) de su elección, ya sea a través de arrastrar y soltar para el pool de datos o mediante un clic derecho y un clic en &quot;Añadir a la piscina.&quot; </li></ol></li></ol> 3. Motivo Buscar <ol><li> Escriba o pegue la secuencia de la consulta (s) en el editor de secuencias en la parte superior de la página web. </li><li> Elija el modelo HMM correcta (por ejemplo Viridiplantae para las plantas). 3,3. Haga clic en &quot;búsqueda de motivos&quot; para iniciar el proceso. </li><li> ITS2 secuencias con motivos señalados son ilustradasTed en la parte inferior de la página web. </li><li> Haga clic en el icono junto a la cabecera de la secuencia para mostrar los motivos señalados en la estructura secundaria. </li></ol> 4. Buscar y Navegar <ol><li> Buscar <ol><li> Tipo de un nombre de taxón o de un identificador de GenBank (GI) en el campo de búsqueda en la parte superior de la página web. </li><li> Una búsqueda por el nombre de taxón es apoyado por una aparición en vivo cuadro de búsqueda. </li><li> Usted puede realizar una búsqueda múltiple por comas para separar sus consultas. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Buscar&quot; para ejecutar la búsqueda. </li><li> Sus resultados aparecen en una lista en una nueva pestaña. </li><li> Haga clic en un nombre de columna para ordenar los resultados según la columna en particular. También puede agregar o quitar columnas de su elección con el menú de la columna. El menú de la columna se puede entrar con un clic en el icono de la flecha que aparece dentro de un nombre de columna. </li><li> Haga clic en &quot;Mostrar detalles&quot; para ver los detalles de una secuencia-estructura. &lt;/ Li&gt; <li> Guarde la secuencia-estructura (s) de su elección, ya sea a través de arrastrar y soltar para el pool de datos o por un clic derecho y un clic en &quot;Añadir a la piscina.&quot; </li><li> Para guardar los resultados en un archivo externo, haga clic en &quot;Guardar selección&quot; o &quot;Guardar todo&quot;. </li></ol></li><li> Navegar <ol><li> Examinar la base de datos ITS2 navegando a través de la estructura de árbol a la izquierda de la página web. </li><li> Haga clic en el signo más para ver los taxones en un nivel inferior. </li><li> Haga clic en el nombre del taxón para abrir una nueva pestaña que contiene cada secuencia-estructura del taxón. </li><li> Haga clic en &quot;Mostrar detalles&quot; para ver los detalles de un par de secuencias-estructura. </li><li> Guarde la secuencia-estructura (s) de su elección, ya sea a través de arrastrar y soltar para el pool de datos o por un clic derecho y un clic en &quot;Añadir a la piscina.&quot; </li><li> Para guardar los resultados en un archivo externo, haga clic en &quot;Guardar selección&quot; o &quot;Guardar todo&quot;. </li></ol></li></ol> 5. ITS2 Blast<ol><li> Escriba o pegue las secuencias de la consulta uno o varios en el editor de secuencias. Sus secuencias de pasos pueden ser simples secuencias de nucleótidos o pares de la estructura de la secuencia. También puede escribir varias estructuras secundarias por debajo de una secuencia. Al marcar la casilla &quot;Serializar secuencias XXFASTA&quot; estas estructuras se utilizan posteriormente como consultas individuales. </li><li> Para iniciar BLAST con la configuración predeterminada, haga clic en &quot;explosiva&quot;. Dependiendo de la naturaleza de la consulta, ya sea un BLASTN común o el BLAST secuencia ITS2-estructura se lleva a cabo. </li><li> Una ficha de sub-se abre para cada secuencia de la consulta dentro de las pestañas que aparecen &quot;Los resultados de BLAST&quot;, así como una visión general de las búsquedas realizadas. </li><li> Haga clic en &quot;Mostrar Alineaciones&quot; para ver las alineaciones de BLAST calculados. </li><li> Save the BLAST hits de su elección ya sea a través de arrastrar y soltar para el pool de datos o por un clic derecho y un clic en &quot;Añadir a la piscina.&quot; </li><li> Para guardar los resultados en un archivo externo, haga clic en &quot;Guardar selección&quot;O&quot; Guardar todo &quot;. </li></ol> 6. Secuencias múltiples estructura de alineación <ol><li> Echa un vistazo a tu reserva de los datos haciendo clic en &quot;Administrar base de datos&quot; y luego el símbolo de la lupa al lado del número de secuencias en su piscina. Alternativamente, puede hacer clic en el signo de pool de datos en la parte inferior izquierda de la página web. </li><li> Haga clic en un par de secuencias-estructura en el banco de datos para ver sus detalles. </li><li> Para crear una secuencia de múltiples estructura de alineación de todos los pares de la estructura de la secuencia en la piscina, haga clic en &quot;Analizar conjunto de datos&quot; y luego &quot;la secuencia y estructura.&quot; </li><li> Ahora se le pedirá que seleccione el modo gráfico de su alineación. Si la alineación contiene sólo unas pocas secuencias, rechazar el modo fino, haga clic en &quot;No&quot; De lo contrario elegir el modo gráfico delgada haciendo clic en &quot;Sí&quot;. </li><li> En algunos momentos, la alineación se muestra en una nueva pestaña (Figura 2). Por otra parte, se guarda automáticamente en el pool de datos. </li><li> Para guardar ella alineación en un archivo externo, haga clic en &quot;Guardar la alineación&quot;. </li></ol> 7. Árbol filogenético <ol><li> Para el cálculo de un vecino de secuencia basado en estructura de árbol de unión de la alineación múltiple, haga clic en &quot;Analizar conjunto de datos&quot; y luego &quot;Neighbor Joining&quot;. </li><li> El árbol resultante se ilustra en una nueva pestaña (Figura 3). </li><li> Escalar el árbol libremente con la barra de desplazamiento &quot;árbol de Zoom.&quot; </li><li> Reroot su árbol haciendo clic en un nodo o una hoja del árbol y luego &quot;Reroot en este nodo.&quot; </li><li> Si desea eliminar un taxón de su banco de datos, haga clic en la hoja y elegir la opción &quot;Eliminar este nodo de la piscina.&quot; Ahora usted puede recalcular su alineación y árbol con el taxón de muestreo reducido. </li><li> Haga clic en &quot;árbol de Guardar&quot; para guardar el árbol filogenético como un resultado final de su análisis a un archivo externo NEWICK. </li></ol> 8. Software adicional <ol><li> Haga clic en &quot;Acerca de este sitio web&quot; - &quot;Herramientas&quot; para encontrar más informar ación sobre la 4SALE independiente herramientas y ProfDistS. </li><li> Además de la alineación y la función Vecino Participar proporcionado por la interfaz de base de datos web ITS2, ahora se puede acceder a varias funciones nuevas, la delimitación especies, por ejemplo sobre la base de cambios de bases compensatorias (CBC). </li></ol> 9. Los resultados representativos El flujo de trabajo como se describe anteriormente ha aplicado con éxito en varios estudios de acceso abierto 3,4. Ejemplos pueden ser vistos a través de los siguientes enlaces: <ul><li> <a href="http://www.plosone.org/article/info%3Adoi/10.1371/journal.pone.0016931" target="_blank">http://www.plosone.org/article/info 3Adoi%%% 2F10.1371 2Fjournal.pone.0016931</a> </li><li> <a href="http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/320" target="_blank">http://www.biomedcentral.com/1756-0500/3/320</a> </li></ul> En estos estudios a gran escala, hemos sido capaces de resolver la filogenia de Chlorophyta, así como Hypnales (Bryophyta) walta resolución i. En ambos casos, un taxón de muestreo exhaustivo se obtuvo de la base de datos ITS2 9, alinea automáticamente con 4SALE 15,16 y por último procesado por ProfDistS 17 en un árbol filogenético. En todos estos pasos, la secuencia y estructura de la información se utilizaron de forma simultánea. Manos a la Obra de apoyo para la columna vertebral filogenético se logró utilizando Vecino perfil de junta (PNJ) 19, que está disponible en la versión independiente de ProfDistS. Para un conjunto más pequeño de los pares de la estructura de la secuencia, las figuras 1 a 3 describen los principales pasos de este flujo de trabajo automatizado 5 directamente en el banco de trabajo de base de datos nueva ITS2: taxón de muestreo, la alineación de secuencias múltiples de estructura y, finalmente, el cálculo de árboles filogenéticos. <img src="/files/ftp_upload/3806/3806fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Taxón de muestreo por arrastrar y soltar. En las secuencias de tiempo o secuencia de estruc-<html> pares electrónicos se pueden añadir a los datos existentes, por ejemplo a través de arrastrar y soltar. Aquí una secuencia-estructura se añade la función de arrastrar y soltar después de la predicción de estructura secundaria. El azul elipse indica el lugar donde se coloca la secuencia-estructura en el banco de datos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3806/3806fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la versión en tamaño completo de esta imagen.</a> <img src="/files/ftp_upload/3806/3806fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Múltiples secuencia-estructura de la alineación en el modo gráfico completo. Para las secuencias en la piscina de datos, el modo gráfico completo fue elegido. Las bases son de color, de pares de bases se pueden resaltar con círculos rojos haciendo clic en una base o soporte de un par de bases. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3806/3806fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la versión en tamaño completo de esta imagen.</a> 3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Secuencia de la estructura Vecino Participar árbol. El árbol libremente escalable calculado de un total de siete taxones múltiples secuencia-estructura de la alineación se pueden guardar en el formato Newick.

<ol>
	<li>Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Including+RNA+secondary+structures+improves+accuracy+and+robustness+in+reconstruction+of+phylogenetic+trees.">Including RNA secondary structures improves accuracy and robustness in reconstruction of phylogenetic trees.</a> Biology Direct. 5, 4-4 (2010).</li><li>Schultz, J., Maisel, S., Gerlach, D., M&#252;ller, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+core+of+secondary+structure+of+the+internal+transcribed+spacer+2+&#40;ITS2&#41;+throughout+the+Eukaryota.">A common core of secondary structure of the internal transcribed spacer 2 &#40;ITS2&#41; throughout the Eukaryota.</a> RNA. 11, 361-364 (2005).</li><li>Buchheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+Transcribed+Spacer+2+(nu+ITS2+rRNA)+Sequence-Structure+Phylogenetics:+Towards+an+Automated+Reconstruction+of+the+Green+Algal+Tree+of+Life.">Internal Transcribed Spacer 2 (nu ITS2 rRNA) Sequence-Structure Phylogenetics: Towards an Automated Reconstruction of the Green Algal Tree of Life.</a> PLoS ONE. 6, 16931-16931 (2011).</li><li>Merget, B., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+phylogeny+of+Hypnales+(Bryophyta)+inferred+from+ITS2+sequence-structure+data.">A molecular phylogeny of Hypnales (Bryophyta) inferred from ITS2 sequence-structure data.</a> BMC Research Notes. 3, (2010).</li><li>Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITS2+sequence-structure+analysis+in+phylogenetics:+a+how-to+manual+for+molecular+systematics.">ITS2 sequence-structure analysis in phylogenetics: a how-to manual for molecular systematics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 52, 520-523 (2009).</li><li>Coleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ITS2+is+a+double-edged+tool+for+eukaryote+evolutionary+comparisons.">ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons.</a> Trends in Genetics. 19, 370-375 (2003).</li><li>Coleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+a+coincidence+between+evolutionary+landmarks+found+in+mating+affinity+and+a+DNA+sequence.">The significance of a coincidence between evolutionary landmarks found in mating affinity and a DNA sequence.</a> Protist. 151, 1-9 (2000).</li><li>M&#252;ller, T., Philippi, N., Dandekar, T., Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+species.">Distinguishing species.</a> RNA. 13, 1469-1472 (2007).</li><li>Koetschan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ITS2+Database+III-sequences+and+structures+for+phylogeny.">The ITS2 Database III-sequences and structures for phylogeny.</a> Nucleic Acids Research. 38, 275-279 (2010).</li><li>Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5.8+S-28S+rRNA+interaction+and+HMM-based+ITS2+annotation.">5.8 S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation.</a> Gene. 430, 50-57 (2009).</li><li>Benson, D., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D., Ostell, J., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 39, 32-37 (2011).</li><li>Markham, N., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization.">Software for nucleic acid folding and hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. , 453-453 (2008).</li><li>Wolf, M., Achtziger, M., Schultz, J., Dandekar, T., M&#252;ller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+modeling+revealed+more+than+20,000+rRNA+internal+transcribed+spacer+2+(ITS2)+secondary+structures.">Homology modeling revealed more than 20,000 rRNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) secondary structures.</a> RNA. 11, 1616-1623 (2005).</li><li>Altschul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Seibel, P., M&#252;ller, T., Dandekar, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+visual+analysis+and+editing+of+RNA+sequence+and+secondary+structure+alignments+using+4+SALE.">Synchronous visual analysis and editing of RNA sequence and secondary structure alignments using 4 SALE.</a> BMC Research Notes. 1, (2008).</li><li>Seibel, P., M&#252;ller, T., Dandekar, T., Schultz, J., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+SALE+-+A+tool+for+synchronous+RNA+sequence+and+secondary+structure+alignment+and+editing.">4 SALE - A tool for synchronous RNA sequence and secondary structure alignment and editing.</a> BMC Bioinformatics. 7, (2006).</li><li>Wolf, M., Ruderisch, B., Dandekar, T., Schultz, J., M&#252;ller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProfDistS:(profile-)+distance+based+phylogeny+on+sequence-structure+alignments.">ProfDistS:(profile-) distance based phylogeny on sequence-structure alignments.</a> Bioinformatics. 24, 2401-2402 (2008).</li><li>Saitou, N., Nei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neighbor-joining+method:+a+new+method+for+reconstructing+phylogenetic+trees.">The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees.</a> Molecular Biology and Evolution. 4, 406-425 (1987).</li><li>M&#252;ller, T., Rahmann, S., Dandekar, T., Wolf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+and+robust+phylogeny+estimation+based+on+profile+distances:+a+study+of+the+Chlorophyceae+(Chlorophyta.">Accurate and robust phylogeny estimation based on profile distances: a study of the Chlorophyceae (Chlorophyta.</a> BMC Evolutionary Biology. 4, (2004).</li><li>Ludwig, W. o. l. f. g. a. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARB:+a+software+environment+for+sequence+data.">ARB: a software environment for sequence data.</a> Nucleic Acids Research. 32, 1363-1371 (2004).</li><li>Néron, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobyle:+a+new+full+web+bioinformatics+framework.">Mobyle: a new full web bioinformatics framework.</a> Bioinformatics. 25, 3005-3011 (2009).</li><li>Camin, J. H., Sokal, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+deducing+branching+sequences+in+phylogeny.">A method for deducing branching sequences in phylogeny.</a> Evolution. 19, 311-326 (1965).</li><li>Felsenstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+trees+from+DNA+sequences:+a+maximum+likelihood+approach.">Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach.</a> Journal of Molecular Evolution. 17, 368-376 (1981).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La base de datos ITS2 es un banco de trabajo completo y totalmente funcional para los internos transcritos de separación de 2 secuencia-estructura-base filogenética. El sitio web puede funcionar muy rápido y de manera intuitiva. Mientras que otros bancos de trabajo basados ​​en la web filogenia como ARB 20 o 21 Mobyle sólo son capaces de trabajar en la secuencia y / o información de la estructura de consenso, la base de datos ITS2 9 considera secuencias y estructuras secundarias individuales para cada taxón al mismo tiempo. Sin embargo, debido a las limitaciones en la capacidad computacional del servidor web, se recomienda utilizar las herramientas independientes para el alineamiento múltiple y Neighbor Joining 18 de cálculo, 4SALE 15,16 y ProfDistS 17, respectivamente, para grandes conjuntos de datos. Al lado de la base de flujo de trabajo ITS2 filogenia de la secuencia de la estructura 5, estas herramientas cuentan con varias funciones adicionales, como el cálculo de repeticiones de arranque, perfil de junta de vecinos (PNJ) 19 o especiedelimitación s sobre la base de cambios de bases compensatorias (CBC) 8. Se puede acceder a través de la &quot;Acerca de este sitio web&quot; - &quot;Herramientas&quot; para su descarga e información detallada. Para utilizar 4SALE y ProfDistS, que es necesario llevar siempre los archivos en el formato correcto. Un taxón de muestreo para ser procesado por 4SALE debe tener el final. FASTA o. Txt, mientras que la alineación de secuencias-estructura como un insumo para ProfDistS debe terminar con. Xfasta. Actualmente estamos implementando métodos alternativos para la reconstrucción del árbol filogenético de la base de datos ITS2, así como en las herramientas relacionadas. Por lo tanto, los métodos, como la secuencia de la estructura basada en parsimonia máxima 22 y / o de máxima verosimilitud 23 se podrá acceder en el futuro.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Acceso a Internet </td><td></td><td> Preferiblemente alta velocidad </td></tr><tr><td> ITS2 de base de datos 9 </td><td> Departamento de Bioinformática de la Universidad de Würzburg </td><td> Sitio Web: <a href="http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de" target="_blank">http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de</a> </td></tr><tr><td> Software: 4SALE 15,16 </td><td> Departamento de Bioinformática de la Universidad de Würzburg </td><td> Descargar: <a href="http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/" target="_blank">http://4sale.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/</a> </td></tr><tr><td> Software: ProfDistS 17 </td><td> Departamento de Bioinformática de la Universidad de Würzburg </td><td> Descargar:NI-wuerzburg.de / &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://profdist.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/ </td></tr></tbody></table>

the its2 database

El espaciador transcrito interno 2 (ITS2) se ha utilizado como un marcador filogenético durante más de dos décadas. Como ITS2 la investigación se centró principalmente en la secuencia ITS2 muy variable, que limita al este marcador de bajo nivel sólo filogenética. Sin embargo, la combinación de la secuencia ITS2 y su estructura altamente conservadas secundaria mejora la resolución filogenética 1 y permite la inferencia filogenética en filas múltiples, incluyendo taxonómicos delimitación especies 2-8. La base de datos ITS2 9 presenta un conjunto de datos exhaustiva de los espaciadores internos transcritos 2 secuencias de NCBI GenBank con precisión reannotated 11 10. Después de una anotación Perfil de modelos ocultos de Markov (HMM), la estructura secundaria de cada secuencia se prevé. En primer lugar, se comprueba si un mínimo de energía en base doble 12 (directa veces) da como resultado una conformación correcta, de cuatro hélices. Si este no es el caso, la estructura espronosticado por el modelo de homología 13. En el modelado de homología, una estructura ya conocida secundaria se transfiere a otra secuencia ITS2, cuya estructura secundaria no fue capaz de doblar correctamente en un pliegue directa. La Base de Datos ITS2 no sólo es una base de datos para almacenamiento y recuperación de la secuencia ITS2-estructuras. También proporciona varias herramientas para procesar sus propias secuencias ITS2, incluyendo la predicción de la anotación, estructural, la detección y el motivo de BLAST 14 de búsqueda de la combinación de secuencia-estructura de la información. Por otra parte, se integra versiones recortadas de 4SALE 15,16 y 17 ProfDistS para el cálculo de alineación de secuencias múltiples, estructura y Neighbor Joining 18 la reconstrucción del árbol. Juntos forman una tubería de análisis coherente de un conjunto inicial de secuencias de una filogenia basada en la secuencia y estructura secundaria. En pocas palabras, esta mesa de trabajo simplifica los análisis filogenéticos de los primeros sólounos pocos clics de ratón, mientras que, además, proporcionar las herramientas y los datos globales para el análisis a gran escala.

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The ITS2 Database

La base de datos ITS2 es un banco de trabajo para la secuencia de inferencia filogenética y al mismo tiempo teniendo en cuenta la estructura secundaria del espaciador transcrito interno 2. Esto incluye la recopilación de datos con la anotación precisa, predicción de estructura, la alineación de secuencias múltiples de estructura y cálculo árbol de rápido. En pocas palabras, esta mesa de trabajo simplifica primeros análisis filogenéticos para unos pocos clics.

La base de datos ITS2

The internal transcribed spacer 2 (ITS2) has been used as a phylogenetic marker for more than two decades.  As ITS2 research mainly focused on the very ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K vistas.  University of Würzburg. La base de datos ITS2 es un banco de trabajo para la secuencia de inferencia filogenética y al mismo tiempo teniendo en cuenta la estructura secundaria del espaciador transcrito interno 2. Esto incluye la recopilación de datos con la anotación precisa, predicción de estructura, la alineación de secuencias múltiples de estructura y cálculo árbol de rápido. En pocas palabras, esta mesa de trabajo simplifica primeros análisis filogenéticos para unos pocos clics.

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Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP &amp; FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Investigación

Biología

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Aislamiento de Neonatal extrahepática cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment Kartchner Caverns, AZ, USA

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

El uso de MALDI-TOF espectrometría de masas y una base de datos personalizada para caracterizar bacterias indígenas a una cueva entorno único (Kartchner Cavernas, AZ, EE.UU.)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparación de muestras para perfiles metabólicos utilizando imágenes de espectrometría de masas MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Aislamiento semiautomatizado de tejido adiposo blanco murino

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor destacado: Aislamiento semiautomatizado de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo blanco murino mediante un disociador de tejidos  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...