著者らは、撮影時の彼の助けニコールM.ネメト（ジョージア大学）と鶏の組織を収穫で彼らの助けのためのジャンヌ·M·フェア（LANL）と、スティーブンA.スプリンガーに感謝したいと思います。この研究ではすべての鳥の世話は、ロスアラモス国立セキュリティ、LLCは、ロスアラモスのオペレータの機関動物実験委員会によって承認された実験動物とすべてのプロトコルの人道的使用のための健康のガイドラインの国立研究所を満たしていた米国エネルギー省との契約番号DE-AC52-06NA25396下の国立研究所。本研究ではマウスのケアはUCSDの動物承認されたプロトコルに準拠しています。ヒトの組織は、UCSDの承認されたIRBのプロトコルの一部として得られた。この作品は、神経疾患や脳卒中の国立研究所（ニューロ顕微鏡共用施設、UCサンディエゴ）からカリフォルニアラボ料大統領プログラム（PG）の大学とグラントNS047101から助成118645によってサポートされていました。

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特別な利害関係は宣言されません。

凍結組織の粘液とグリカンエピトープの保全は、パラフィン包埋した組織のものよりも優れている。我々は、分泌された粘液層の保全（ 図1および図3）、パラフィン包埋された組織と比較して凍結した組織内の3糖鎖構造（ 図3）の分布を示した。そのようなカルノア液（60％エタノール、30％クロロホルム、10％酢酸）17などの特殊な固定剤は、組織サンプル中の粘液層の最適な保全のために開発されている。理想的には、この溶液は粘液研究のために専用されており、粘液層16から17の滑らかな外観を維持することが示された組織サンプルを収集するために使用されるべきである。 10月中に埋め込まれた未定着凍結サンプルの粘液層が表示され、ゴツゴツしたいくつかの地域で組織から切り離すかもしれませんが、全体的な層の厚さはカルノア液およびembeddで固定した組織で観察されたものと一致しているパラフィン16から17のed。 16 -例えば、凍結ヒト結腸組織切片における粘液層がCarnoy&#39;s固定ヒト結腸サンプル55.4±2.5μmである（204.8μmの範囲7.7）のために報告された範囲内にある〜100μm程度（ 図1）です。 それは、何十年も前から知られており、その結果生体試料18〜30％収縮し、組織13からキシレンなどの有機溶剤、Citrisolvとある程度クロロホルム抽出脂質、糖脂質とは、タンパク質がその中のエタノール脱水の結果。固定（10％緩衝ホルマリン）、脱水（増加エタノール濃度）、およびクリア（Citrisolvまたはキシレン）：パラフィン包埋組織のための処理は、次の手順が含まれます。未固定凍結組織切片の上にこれらの手順を模倣することによって、我々はCitrisolvが（Figurパラフィン包埋組織のものに類似している組織形態が生じる凍結組織切片からの粘 ​​液を抽出することを実証e 2と、右パネル）。これとは対照的に、粘液層（ 図2、左と中央パネル）ホルマリンまたはエタノールとのインキュベーションによって変化しなかった。 Citrisolv /キシレンで長時間のインキュベーション、粘液層の崩壊の結果を必要とする標準的なパラフィン包埋手順のクリアステップ、このことが示唆している。ホルマリン固定は粘液層にダメージを与えないとホルマリンで固定した凍結組織切片を、容易にグリカン、糖脂質およびタンパク質（ 図2、図3及び図6）に対するレクチンや抗体で染色することができます。これらの効果は、膜結合タンパク質および組織病理学の研究のために無視できるかもしれないが、彼らはそのような分泌粘液層のような高度に水和した構造のために荒廃しています。しかしムチンの組織学的研究はまだ粘液層の保全が次善であるパラフィン包埋サンプルを主に行っています。そのような自体の正確なIDとして粘液層組成の深さの分析でcretedまたは膜結合MUC糖タンパク質の組み合わせは、特異的抗体とタンパク質バックボーンの同定のための質量分析を必要とします。粘液層の保全は、このような研究のための初期の要件ですが。 多くの研究室では、さまざまなプロジェクトのために、過去に収集した10月中に凍結組織サンプルを持って、これらの組織は、容易にムチン、糖脂質および粘液の保全のために独自に設計された特殊な固定液中に組織を収集する必要性を排除する糖鎖分布を調べるために使用することができます。凍結した組織では、最小限の処理を受けるため、自然の中で水和している糖鎖の天然分布は、保持されます。これは、微生物 - 宿主相互作用の分野では特に重要である。これらの &quot;障壁&quot;分子飾る分泌ムチンと多くのグリカン構造の自然主義的な分布と個体数の知識は、宿主の防御、微生物の搾取とpathogenesを理解する上で鍵となるだろうです。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 2 - メチルブタン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 03551から4 </td></tr><tr><td> AECのペルオキシダーゼ基質キット</td><td>ベクトルラボ</td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3157 </td></tr><tr><td>抗CA19-9モノクローナル抗体</td><td>カルビオケム</td><td> CA1003 </td></tr><tr><td>抗MUC5ACモノクローナル抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td>アビジン - ビオチンブロッキング·キット</td><td>ベクトルラボ</td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td>ビオチン化ロバ抗マウス抗体</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 90863 </td></tr><tr><td>ビオチン化SNA </td><td>ベクトルラボ</td><td> B-1305 </td></tr><tr><td>ウシ血清albu分</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4503 </td></tr><tr><td>キチン加水分解物</td><td>ベクトルラボ</td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td>クライオスタットミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>ライカCM 1800 </td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td> Surgipath医療ケガニ</td><td> 3801570 </td></tr><tr><td>過酸化水素30パーセント</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> H325-100 </td></tr><tr><td>ジャカリン - FITC </td><td>ベクトルラボ</td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td>マイヤーのヘマトキシリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> MHS32 </td></tr><tr><td>メリビオース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M5500 </td></tr><tr><td>核ファーストレッド</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> OCTコンパウンド</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン</td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 94638 </td></tr><tr><td>シッフ試薬</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-ローダミン</td><td>ベクトルラボ</td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2モノクローナル抗体</td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount水性封入剤</td><td>ベクトルラボ</td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 8310から4 </td></tr><tr><td>ピールウェイ金</td><td>ポリサイエンス社</td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

using unfixed, frozen tissues to study natural mucin distribution

ムチンは重量1-3で70％以上の炭水化物を含む複雑かつ高度にグリコシル化され、O-結合型糖タンパク質である。杯細胞と胃粘膜によって生成分泌ムチンは、腸や気道の3,4行は上皮そのマイクロメートル厚の粘液層のための足場を提供する。ムチンに加えて、粘液層は、抗菌ペプチド、サイトカイン、および免疫グロブリン5-9を含む。粘液層は、ホスト自然免疫の重要な部分であり、微生物8,10-12を侵略に対する最初の防衛線を形成している。このように、粘液は、微生物との多数の相互作用に従うものとし、両方の病原体と共生し、分泌ムチンは、これらの相互作用のための重要なインタフェースを形成します。そのような生物学的相互作用の研究は、通常、組織採取と染色のための組織学的方法を含む。組織採取とpreserv用の2つの最も一般的に使用される組織学的方法クリニックで、研究所でationは、次のとおりです。冷凍保護剤メディアに埋め込む続いパラフィン包埋し、組織の凍結が続き、ホルマリン固定。 パラフィン包埋組織サンプルは、明快さと明確に定義された形態を含む組織学的可視化のための最適な性質を持つセクションを生成します。しかし、パラフィン包埋処理中にエピトープの数が変更され、これらのエピトープを勉強するためには、組織切片は、さらに多くのエピトープ検索方法13のいずれかで処理しなければならないとなる。分泌されるムチンと脂質は有機溶剤（キシレンまたはCitrisolv）とのインキュベーションを延長する必要パラフィン包埋クリア化ステップの間に、組織から抽出されます。したがって、このアプローチでは、in vivoでのムチンや粘液の性質や分布に着目した研究のためのサブ最適です。 これとは対照的に、最適切断温度で凍結組織（OCT）は培地埋め込みボイド試料の脱水及び清算、サンプルの水和を維持します。これは、水和した粘液層のより良い保存を可能にし、従って上皮生物学におけるムチンの多数の役割の研究を可能にします。この方法は、組織の最小限の処理を必要とするため、組織は、より自然な状態で保存されています。したがって凍結組織切片は染色前に、追加の処理を必要とせず、容易に免疫組織化学法を用いて解析することができます。 我々は、冷凍結腸サンプルにおけるマイクロメートル厚の分泌粘液層の保全を実証している。同じ組織をパラフィン包埋されている場合、この層を大幅に低減されます。我々はまた、植物レクチンを用いたムチン型糖鎖上に提示されるエピトープの免疫蛍光染色を示す。このアプローチの利点は、それが特別な固定剤の使用を必要とし、すでに研究室に保存されることもあり凍結組織を活用できていないということです。

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Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

最適切断温度の媒体（10月）に埋め込まれた未固定凍結組織サンプルは分泌粘液の自然分布とグリコシル化を研究するために使用することができます。このアプローチ組織処理に最小限であり、糖脂質、ムチンおよび糖鎖エピトープの自然なプレゼンテーションが保存されています。組織切片を蛍光や発色検出を用いた免疫組織化学によって分析することができる。

天然ムチンの分布を調べ不定、凍結組織を用いた

Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

47.5K ビュー.  University of California, San Diego. 最適切断温度の媒体（10月）に埋め込まれた未固定凍結組織サンプルは分泌粘液の自然分布とグリコシル化を研究するために使用することができます。このアプローチ組織処理に最小限であり、糖脂質、ムチンおよび糖鎖エピトープの自然なプレゼンテーションが保存されています。組織切片を蛍光や発色検出を用いた免疫組織化学によって分析すること...