Os autores gostariam de agradecer a Nicole M. Nemeth (University of Georgia) e Jeanne M. Feira (LANL) por sua ajuda na colheita de tecidos de galinha, e Steven A. Springer por sua ajuda durante as filmagens. O cuidado de todas as aves em estudo estava em conformidade com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde para o uso humano dos animais de laboratório e todos os protocolos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comissões de Uso do Los Alamos National Security, LLC, operadora do Los Alamos Laboratório Nacional sob Contrato n º DE-AC52-06NA25396 com o Departamento de Energia dos EUA. O cuidado de camundongos deste estudo está em conformidade com UCSD protocolo animal aprovado. Tecidos humanos foram obtidos como parte da UCSD protocolo IRB aprovado. Este trabalho foi financiado por bolsa 118645 da Universidade da Califórnia Lab Programa Taxa Presidente (PG) e NS047101 concessão do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (Mecanismo de Microscopia Neuroscience compartilhada, UC San Diego).

1. A incorporação de tecidos em outubro <ol><li> Preparar um banho de congelação de gelo seco através da adição de 2-metil-butano em uma caixa de Styrofoam raso. </li><li> Colheita do tecido, e gentilmente húmido sobre um papel de tecido para secar o excesso de líquido. Se usar snap-congelado tecido (tecido que foi congelado em azoto líquido), permitem que o tecido se aquecer para -20 ° C, colocando-o em uma câmara de crio-micrótomo. </li><li> Adicionar uma pequena quantidade de OCT para o molde Peel-A-Way congelação, apenas o suficiente para cobrir a parte inferior do molde. </li><li> Colocar o tecido no molde, certifique-se de que o tecido é repousou no fundo do molde na orientação desejada. Uma vez congelado, o bloco de tecido vão ser seccionadas a partir do fundo ou pelos lados. </li><li> Cobrir o tecido com OCT, e colocar o molde no banho de congelação. O composto outubro ficará branco como o tecido se congela. </li><li> Uma vez congelado, descascar o molde fora do bloco congelado e coloque em um saco marcado congelamento. </li><li> Os blocos congelados podem ser mantidosà temperatura de -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Tecido Seccionamento <ol><li> Coloque os blocos de tecido na câmara de crio-micrótomo, e lhes permitem chegar a -20 ° C (cerca de 30 min). </li><li> Cortar uma secção de 3-5 mm de espessura, e colocar uma lâmina de vidro de carga positiva na parte superior da secção. O tecido irá aderir à lâmina. </li><li> Secar os tecidos durante 30-60 min. </li><li> As lâminas podem ser usados ​​nesta fase, ou eles podem ser mantidos à temperatura de -80 ° C para uso futuro. </li></ol> 3. Coloracao de tecidos <ol><li> As lâminas que foram armazenadas a -80 ° C: permitir que as lâminas para descongelar e secar ao ar à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Fixar as lâminas com 10% de formalina tamponada durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes em PBS ou tampão TBST, para cada lavagem mergulhar as lâminas 10 vezes em 250 ml de tampão. Tampão PBS pode ser utilizado para a coloração de imunofluorescência, no entanto, para a detecção cromogénica com Fosfatase Alcalina Conjug-ated anticorpo, TBST deve ser usado uma vez que o fosfato de PBS inibe a actividade da fosfatase alcalina. </li><li> Lâminas de cortes histológicos agora está pronto para ser manchada. </li></ol> 4. Usando manchas histoquímicos como Alcian Blue e Ácido Periódico de Schiff para detectar Muco <ol><li> Alcian Blue mancha: <ol><li> Enxaguar as lâminas em água, incubar em 3% de ácido acético durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Cora com Alcian Blue solução de pH 2,5 durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas em água corrente da torneira durante 10 minutos, enxaguar em água desionizada. </li><li> Contracoloração em vermelho rápido nuclear durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas três vezes em água desionizada. </li></ol></li><li> Ácido Periódico de Schiff mancha: <ol><li> Enxaguar as lâminas em água, preparado de fresco incubar em 1% de ácido periódico para 5 min. </li><li> Lavar três vezes em água desionizada, uma vez que mergulha na água MiliQ. </li><li> Mancha com o reagente de Schiff durante 15 min a temperatur quartoe. </li><li> Lavar as lâminas em água corrente da torneira durante 10 minutos, enxaguar em água desionizada. </li><li> Contracoloração em Surgipath hematoxilina durante 30 segundos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas três vezes em água desionizada. </li><li> Incubar as lâminas 30 seg em água de Scott torneira à temperatura ambiente. </li><li> Lavar três vezes em água desionizada. </li></ol></li><li> Desidratar e limpar as lâminas através da incubação de 1 min em etanol a 95%, seguida por três mudanças rápidas em etanol a 100%, e três mudanças de Citrisolv, 2 min cada. Todos à temperatura ambiente. </li><li> Monte slides em lamínulas com meio resinosos (Cytoseal 60). </li></ol> 5. Utilizando lectinas e anticorpos (Tabela 1) para detectar epítopos de glicano por métodos histoquímicos <ol><li> Para a detecção de fluorescência de três epítopos de glicano utilizando lectinas, bloquear as lâminas com BSA a 1% em PBS durante 10-30 min à temperatura ambiente. </li><li> Uma vez que uma lectina biotinilada é usado, bloquear biotina endógena por incubação de 15 min com 0,1%Avidina, seguido de 15 min de incubação com biotina 0,01% à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas em PBS após cada passo de bloqueio. </li><li> Recém preparar uma mistura de 1 ug / ml de rodamina conjugada com aglutinina de gérmen de trigo succinilada (sWGA), 1,3 ug / ml de biotina Sambucus nigra aglutinina (SNA) e 5 ug / ml de fluoresceína jacalina-conjugado em HEPES / NaCl tampão (HEPES 10 mM, 150 mM NaCl pH 7,5). </li><li> Colocar as lâminas em uma superfície plana ou numa caixa de coloração, e a camada de mistura de lectina no topo. O volume de mistura pode ser reduzido pela colocação de parafilme suavemente sobre o líquido, o parafilme achata o líquido e evitar a evaporação. </li><li> Incubar 1 hora à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar as lâminas três vezes com PBS. </li><li> Lâminas de camada com 0,7 ug / ml de estreptavidina conjugada com CY5 (para detectar a biotina-SNA), e incubar durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar as lâminas três vezes com PBS. </li><li> Contracoloração núcleos com 0,1 m &amp;u, g / ml de DAPI. </li><li> Montar as lâminas em lamelas com meio aquoso tal como VectaMount meios de fixação (ou qualquer meio aquoso). </li></ol> 6. Controlando a Especificidade de coloração Lectina <ol><li> Especificidade coloração lectina é controlado ou por clivagem enzimática específica do epítopo alvo glicano antes da coloração ou por competição com moléculas pequenas. </li><li> Clivagem enzimática para Sambucus nigra aglutinina (SNA) especificidade de ligação <ol><li> Diluir Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) a 250 mU / ml em 50 mM de acetato de sódio pH 5,5. </li><li> Adicionar água para o fundo de uma caixa vazia ponta-, isso irá formar uma câmara húmida durante a incubação. </li><li> Colocar as lâminas voltadas para cima na bandeja superior do, camada de ponta-caixa 150-200 solução AUS ul no slide e cobrir com uma lamela. Evitar a formação de bolhas de ar. </li><li> Fechar a tampa da caixa e incubar a 37 ° C durante 2,5 horas. </li><li> Lavar as lâminas três vezes em PBS a têmpera quartotura para remover todos os ácidos siálicos livres. Esses slides deve ser negativo para a coloração SNA. </li></ol></li><li> Os inibidores competitivos para jacalina e succinilado aglutinina do germe de trigo especificidade (sWGA) <ol><li> Alíquota de 200 ul da mistura preparada no passo lectina 5,4 a dois frascos de Eppendorf. </li><li> Adicionar 200 mM Melibiose (inibidor jacalina) a um dos frascos e quitina-hidrolisado a uma diluição de 1:10 (sWGA inibidor) para a outra cuvete. </li><li> Sobreposição negativos lâminas de controlo com o que contém os inibidores da mistura e incubar 1 hora à temperatura ambiente, ao mesmo tempo que o resto dos slides. Esses slides deve ser negativo para jacalina ou coloração sWGA, respectivamente. </li></ol></li></ol> 7. Resultados representativos Uma comparação entre amostras de tecido embebidos em parafina para tecidos congelados embutidos em crio-protetores mídia (outubro) revelou diferença marcante na preservação e qualidade de coloração para Muciglicoproteínas n. Coloração histoquímica de tecidos com corantes, tais como Alcian Blue e ácido periódico de Schiff, produzir resultados muito diferentes em secções de tecido congeladas ou comparáveis ​​de amostras parafinizadas (Figura 1). Afigura-se que o solvente orgânico (ou xileno Citrisolv) que é utilizado durante o processo de inclusão em parafina afecta a distribuição de mucinas segregadas em epitélios bem como a remoção tanto dos glicolípidos a partir das amostras (Figura 2). Como resultado, a camada de muco aparece recolhido nas células da mucosa e é encontrada principalmente nas células caliciformes. Flash congelamento de tecidos em crio-protetores de mídia (outubro) manteve a hidratação da amostra e preservadas as dimensões da camada de mucinas secretadas. O processo de inclusão em parafina afectados outros muco-glicanos e glicolípidos associados de uma maneira similar. Distribuição glicano foi examinada utilizando lectinas, que são rotineiramente usadas para detecção de glicano (Figura 3) e os anticorpos contra epítopos encontradosmucinas e glicolípidos (Figura 6). Porque a ligação da lectina não é bem definido e é afectada pela distribuição espacial dos glicanos, assim como a estrutura de glicano 14,15, é importante aplicar os controlos apropriados para a coloração com lectina. Aqui demonstramos dois métodos para controlar manchas de lectina sobre os tecidos testados: de clivagem enzimática e de inibição competitiva. A clivagem dos epítopos de glicano foi feito através da digestão da secção de tecido com glicano específicos de enzimas, por exemplo sialidase bacteriana como controlo para a ligação de ácido siálico por SNA (Figura 4). Nos casos em que a enzima específica (por exemplo glicosidases) não estão disponíveis para a remoção do epítopo glicano estudada, a especificidade da lectina pode ser confirmada pela adição de um inibidor competitivo, tais como Melibiose jacalina para coloração ou quitina-hidrolisado para coloração sWGA (Figura 5). Nós demonstramos aqui que as amostras de tecido snap-congelados, que são routinely obtido na clínica e em laboratórios de investigação, pode ainda ser incorporado em OCT e utilizado para estudar moléculas de mucina e os glicanos muitos presentes neles. <table border="1"><tbody><tr><td> Lectina / Ab </td><td> Fonte </td><td> Maior especificidade </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (lesma Amarelo) </td><td> Terminal Sia </td></tr><tr><td> * MAA </td><td> Maackia amurensis (Amur Maackia) </td><td> Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-sulfato em Galp1-R </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (sabugueiro) </td><td> Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc </td></tr><tr><td> WGA </td><td> Triticum vulgaris (germe de trigo) </td><td> GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Triticum vulgaris succinilado (germe de trigo) </td><td> GlcNAc &amp; beta; 4GlcNAcβ1 1-4GlcNAc- </td></tr><tr><td> ANP </td><td> Arachis hypogaea (amendoim) </td><td> Galp1-3GalNAc (não modificada do antigénio T) </td></tr><tr><td> Jacalina </td><td> Artocarpus integrifolia (jacalina) </td><td> Galp1-3GalNAc encontrado em O-linked glycans </td></tr><tr><td> ECA </td><td> Erythrina cristagalli (árvore Coral) </td><td> Galp1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> Anticorpo </td><td> Siaa2-6GalNAc (STN), em O-glicanos ligados </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> Anticorpo </td><td> Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (LES a) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> Anticorpo </td><td> Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (sLex) </td></tr></tbody></table> Abreviaturas: Ab, anticorpos; Sia, ácido siálico; Gal, Galactose; GalNAc, <em&gt; N-acetilgalactosamina; GlcNAc, N-acetilglucosamina; Fuc, fucose; STN, sialilo Tn; SLE um, sialil Lewisa; sLex, sialil Lewis x. * Fontes comerciais para MAA incluem MALI, MALII &amp; MAH. Tabela 1. Uma lista parcial de lectinas e anticorpos para epítopos de glicano. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> Figura 1. E coloração com Alcian Blue Periodic Acid Schiff de tecidos do cólon e congelados embebidos em parafina. Secções de tecido de rato, humano ou amostras de cólon frango congelados em OCT (painel superior) ou embebidos em parafina (painel inferior) foram corados com ácido periódico de Schiff (PAS) ou Alcian Blue (AB). Estes reagentes mancha muco rosa ou azul, respectivamente. Painel superior: Em tecidos congelados, para além de mucinas das células caliciformes, muco secretado foi também visvel (setas). Painel inferior: Na-tecidos embebidos em parafina, coloração com muco estava confinada a células caliciformes. Os núcleos foram contrastadas com Surgipath (PAS) ou (AB) de hematoxilina de Mayer. Barra de escala indica 100 mm. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> Figura 2. Resultados de incubação Citrisolv em perda substancial de mucinas. Secções seriadas de amostras de íleo de galinha congeladas foram fixados em formalina tamponada a 10% e mantidos hidratados (painel esquerdo), desidratados em etanol, por incubação sequencial de 70%, 90% e etanol a 100% durante 20 min cada (painel do meio), ou desidratados em etanol e aclarado com Citrisolv durante 1 hora (painel da direita). Amostras desidratadas foram reidratados volta à PBS antes de Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) ou coloração Alcian Blue. Desidratação de etanol e Citrisolv compensação melhor tecido morphology (linha, por exemplo, alto, médio e imagens direita versus imagem à esquerda). Desidratação de etanol não teve efeito significativo na coloração Alcian Blue (linha do meio, comparar as imagens esquerda e do meio). Em contraste, a incubação Citrisolv reduzida coloração azul Alcian e confinada a células caliciformes (linha do meio, a imagem da direita) num padrão que é semelhante à observada em tecidos embebidos em parafina (Figura 1). Estes dados implicam que a forte coloração de grânulos de muco em parafinizado é devido ao encolhimento e de condensação de muco nas células caliciformes durante a etapa de limpeza. A coloração mais fraca e menos denso do muco em congelados OCT-tecidos embebidos reflecte uma distribuição mais natural de muco no tecido. Ampliações de áreas dentro de caixas são marcadas com setas. Barras de escala indicam 50 fim (linhas superior e do meio) e 10 uM (linha inferior). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> Figura 3. A ligação delectinas para epitopos glicano em tecidos congelados e parafina. Frango intestino delgado (íleo) espécimes congelados em outubro (painéis superiores) ou em parafina (painéis inferiores) foram sondados com jacalina (azul), sWGA (verde) e SNA (vermelho ). Ampliações de áreas dentro de caixas são marcadas com setas. Em tecidos congelados jacalina ligação para O-glicanos ligados revelaram estruturas que parecem ser exsudação a partir de células caliciformes no lúmen (jacalina, painel superior, as flechas). Em contraste, a ligação jacalina para tecidos embebidos em parafina foi confinada às células caliciformes (jacalina, painel inferior, setas) e para a borda em escova das vilosidades (imagem inferior esquerda, seta). sWGA coloração de β1-4GlcNAc parcialmente co-localizada com a ligação da lectina jacalina em ambos os tecidos congelados (painel superior, setas), e em tecidos embebidos em parafina (painel inferior, setas). Em contraste, a lectina de ligação a SNA α2-6 ácidos siálicos ligados é intracelular (SNA, pontas de seta), e não se co-localizar com jacalina (corimagem, o SNA em vermelho marcado com seta, jacalina em azul marcado com a seta pontilhada). Barras de escala indicam 100 mm (imagens à esquerda) e 20 um (áreas ampliadas em caixa). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> Figura 4. A clivagem enzimática de controlo para a coloração de ácido siálico com SNA. Espécimes galinha intestino delgado foram incubadas com 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens sialidase (AUS) ou com 50 mM de tampão de acetato de sódio a pH 5,5 durante 2,5 horas a 37 ° C. AUS tratamento elimina a coloração com biotinilado SNA, confirmando SNA especificidade de ligação a resíduos de ácido siálico. Barra de escala indica 100 mm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> Figura 5. Controle de inibição competitiva para a coloração de glicano com jacalina e sWGA. Galinha do intestino delgado (íleo) amostras foram incubadas com uma mistura jacalina sWGA e na presença de lec específicoinibidores de estanho: melibiose (coluna do meio), quitina-hidrolisado (coluna da direita) e sem inibidor (A e D). Painel superior: (esquerda) jacalina coloração sem inibidores. (Centro) coloração jacalina foi inibida por Melibiose. (Direita) Quitina-hidrolisado não inibiu coloração jacalina. Painel inferior: (esquerda) sWGA coloração sem inibidor. (Centro) Melibiose não inibiu a coloração sWGA. (Direita) coloração sWGA foi inibida por quitina-hidrolisado. Isto confirma a inibição da interacção específica de lectinas com os tecidos. Asteriscos imagem marca de inibição de coloração. Barra de escala indica 100 mm. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> Figura 6. Detecção de mucinas secretoras, glicolipídios e epítopos glicano em tecidos humanos congelados câncer colorretal. Biópsias de câncer colorretal de carcinoma de vilosidades e carcinoma muco foram snap-congelado em nitrogênio líquido e incorporado em outubro As secções de tecido foram incubadas durante 1 hcom anticorpos contra a mucina segregada MUC5AC, sialil Lewis a - glicano epítopo encontrado em gangliósidos (cancro colorectal marcador CA 19-9) e sialil-Tn - epitopo glicano abundante em mucinas (detectado com anticorpo TKH2), seguido por 30 min de incubação com biotinilado de burro anti-rato IgG de anticorpo secundário, e 30 minutos de incubação com peroxidase conjugada com estreptavidina. Outros tecidos foram incubados durante 1 hora com o biotinilado lectinas SNA e sWGA, seguido por 30 minutos de incubação com peroxidase conjugada com estreptavidina. A coloração da peroxidase foi desenvolvida utilizando AEC kit. Barra de escala preta indica 200 m.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Preservação de muco e glicano epítopos em tecidos congelados é superior à dos tecidos que foram embebidos em parafina. Nós demonstramos a preservação da camada de muco secretado (Figuras 1 e 3) e a distribuição de três estruturas de glicanos (Figura 3), em comparação com tecidos congelados embebidos em parafina tecidos. Fixadores especializados, tais como solução de Carnoy (etanol a 60%, clorofórmio a 30%, 10% de ácido acético) 17 ter sido desenvolvido para a conservação óptima da camada de muco em amostras de tecido. Em condições óptimas, esta solução deve ser utilizado para recolher amostras de tecido que são dedicados para estudos de muco e foi mostrado para preservar a aparência lisa da camada de muco 16-17. A camada de muco em amostras congeladas não fixadas incorporado em OCT parece resistente e em algumas áreas pode separar a partir do tecido, no entanto, a espessura de camada total está de acordo com o observado em tecidos que foram fixados com solução de Carnoy e embedded em parafina 16-17. Por exemplo, a camada de muco na secção de tecido do cólon humano congelado é de ~ 100 mm (Figura 1), que está dentro do intervalo descrito para Carnoy&#39;s fixo amostra de cólon humano de 55,4 ± 2,5 um (intervalo 7,7-204,8 mm) 16. Tem sido conhecido durante décadas, que resulta em desidratação de etanol ~ o encolhimento de 30% das amostras biológicas 18, e que os solventes orgânicos tais como xileno e lípidos Citrisolv extracto de clorofórmio, glicolípidos e, em certa medida, das proteínas a partir dos 13 tecidos. Processamento de tecidos para inclusão em parafina inclui as seguintes etapas: fixação (10% de formalina tamponada), desidratação (aumentando a concentração de etanol), e de compensação (Citrisolv ou xileno). Imitando estes passos não fixadas em secções de tecido congeladas, foi demonstrado que Citrisolv extrai muco a partir de secções de tecido congeladas, resultando em morfologia de tecido que é semelhante ao de tecidos embebidos em parafina (Figure 2, painel da direita). Em contraste, a camada de muco não foi alterada pela incubação com formalina ou etanol (Figura 2, para a esquerda e painéis centrais). Isto sugere que a etapa de limpeza de um procedimento padrão inclusão em parafina, o qual requer a incubação prolongada em Citrisolv / xileno, resulta no colapso da camada de muco. Fixação em formalina não danifica a camada de muco e secções congeladas de tecidos que foram fixadas com formalina pode ser facilmente manchado com lectinas e anticorpos contra glicanos, glicolípidos e proteínas (Figuras 2, 3 e 6). Estes efeitos podem ser insignificante para o estudo de proteínas ligadas à membrana e os tecidos patologia, mas eles são devastadoras para as estruturas altamente hidratados, tais como a camada de muco secretado. No entanto estudos histológicos de mucinas são ainda realizados principalmente com amostras embebidas em parafina, nas quais a camada de muco preservação é de qualidade inferior. Em análises aprofundadas de composição do muco camada como a identidade precisa de sicreted ou ligados membrana glicoproteína MUC combinações exigem anticorpos específicos e de espectrometria de massa para a identificação dos esqueletos proteicos. Preservação da camada de muco é, mas a exigência inicial para esses estudos. Muitos laboratórios têm amostras de tecidos congelados em OCT que foram recolhidos no passado por diferentes projectos, estes tecidos podem ser prontamente usados ​​para estudar as mucinas, glicolípidos e distribuição de glicano eliminando a necessidade de recolha de tecidos em fixadores especiais que são concebidos exclusivamente para a preservação de muco. Tecidos congelados objecto de processamento mínimo e, por conseguinte, a distribuição natural de glicanos, que são hidratados na natureza, é preservado. Isto é especialmente importante no reino do microbiana acolhimento interações. Conhecimento da distribuição e abundância naturalista de mucinas secretadas e as estruturas glicano muitos decorar esses &quot;barreira&quot; moléculas será a chave para a compreensão de defesa do hospedeiro, a exploração microbiana e patógenosé.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente e equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 2-metilbutano </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03.551-4 </td></tr><tr><td> AEC kit de substrato de peroxidase </td><td> Vector Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alcian Blue </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Anti-CA anticorpo monoclonal 19-9 </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Anti-MUC5AC anticorpo monoclonal </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidina-biotina bloqueio kit </td><td> Vector Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biotinilado burro anticorpo anti-rato </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> Biotinilado SNA </td><td> Vector Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovinomin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Chitin-hidrolisado </td><td> Vector Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Criostato micrótomo </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Surgipath Medical Ind. </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> Peróxido de hidrogénio a 30% </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalina-FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Hematoxilina de Mayer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Red Rápido nuclear </td><td> Vector Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> Composto outubro </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Estreptavidina conjugada com peroxidase </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Reagente de Schiff </td><td> Elétrons ciências microscopia </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rodamina </td><td> Vector Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 anticorpo monoclonal </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount aquosos de montagem </td><td> Vector Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Descasque-A Way moldes </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

using unfixed, frozen tissues to study natural mucin distribution

As mucinas são complexos e altamente glicosilada O-linked glicoproteínas, que contêm mais do que 70% em peso de hidratos de carbono 1-3. Mucinas segregadas, produzido pelas células caliciformes e a mucosa gástrica, o andaime para fornecer uma camada de muco micrômetros de espessura, que reveste o epitélio do intestino e do trato respiratório 3,4. Além de mucinas, as camadas de muco também contêm péptidos antimicrobianos, citoquinas, e as imunoglobulinas 5-9. A camada de muco é uma parte importante da imunidade do hospedeiro inato, e forma a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos 8,10-12. Como tal, o muco é objecto de numerosas interacções com micróbios, ambos os patógenos e simbiontes, e mucinas segregadas constituem uma interface importante para estas interacções. O estudo de tais interacções biológicas normalmente envolve métodos histológicos para a recolha de tecidos e de coloração. Os dois mais utilizados métodos histológicos para a recolha de tecidos e preservandoção na clínica e em laboratórios de pesquisa são: a fixação de formalina seguido de parafina e congelamento de tecido, seguido de incorporação em crio-protetores mídia. Amostras de tecido emblocado em parafina produzir seções com qualidades ideais para a visualização histológica incluindo clareza e bem definida morfologia. No entanto, durante o processo de incorporação de um número de parafina de epitopos se alterou e, a fim de estudar estes epítopos, as secções de tecido têm de ser posteriormente tratados com um dos métodos de recuperação de epítopo de muitas 13. Mucinas segregadas e lípidos são extraídos do tecido durante o passo de compensação inclusão em parafina, a qual requer prolongar a incubação com solventes orgânicos (ou xileno Citrisolv). Portanto, esta abordagem é sub-ótima para estudos sobre a natureza e distribuição de mucinas e muco in vivo. Em contraste, os tecidos de congelamento na temperatura de corte ótima (outubro) a incorporação de um meiovazios desidratação e limpeza da amostra, e mantém a hidratação da amostra. Isto permite uma melhor conservação da camada de muco hidratada e, assim, permite o estudo das várias funções de mucinas em biologia epitelial. Como este método requer um tratamento mínimo do tecido, o tecido é conservado num estado mais natural. Secções congeladas de tecidos, por conseguinte, não necessitam de qualquer tratamento adicional antes da coloração e pode ser facilmente analisada através de métodos imuno-histoquímicos. Nós demonstramos a preservação de micrômetros de espessura da camada de muco secretado em amostras de cólon congelados. Esta camada é drasticamente reduzida quando os mesmos tecidos são embebidas em parafina. Também demonstramos coloração por imunofluorescência de epítopos de glicano apresentados em mucinas utilizando lectinas vegetais. A vantagem desta abordagem é a de que ele não requer o uso de fixadores especiais e permite a utilização de tecidos congelados que já podem ser conservadas no laboratório.

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Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Não fixadas amostras de tecidos congelados embebidos em meio óptimo de temperatura de corte (OCT) podem ser usados ​​para estudar a distribuição natural e glicosilação de muco secretado. Neste processamento de tecidos abordagem é mínima e a apresentação natural de glicolípidos, mucinas e glicano-epítopos é preservada. As secções de tecido podem ser analisados ​​por imuno-histoquímica utilizando detecção por fluorescência ou cromogénico.

Usando unfixed, tecidos congelados para estudar a distribuição de mucina Natural

Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

47.5K visualizações.  University of California, San Diego. Não fixadas amostras de tecidos congelados embebidos em meio óptimo de temperatura de corte (OCT) podem ser usados ​​para estudar a distribuição natural e glicosilação de muco secretado. Neste processamento de tecidos abordagem é mínima e a apresentação natural de glicolípidos, mucinas e glicano-epítopos é preservada. As secções de tecido podem ser analisados ​​por imuno-histoquímica utilizando detecção por fluorescência ou cromogénico.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Gerados por computador Modelo Estímulos animal

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to employ reverse genetics have not yet been adequately developed to assess gene function in regeneration or tissue homeostasis during larval stages after zebrafish embryogenesis, and several tissues within the zebrafish larva are difficult to target. Intraventricular injections of gene-specific morpholinos offer an alternative method for the current inability to genomically target zebrafish genes in a temporally controlled manner at these stages. This method allows for complete dispersion and subsequent incorporation of the morpholino into various tissues throughout the body, including structures that were formerly impossible to reach such as those in the larval caudal fin, a structure often used to noninvasively research tissue regeneration. Several genes activated during larval finfold regeneration are also present in regenerating adult vertebrate tissues, so the larva is a useful model to understand regeneration in adults. This morpholino dispersion method allows for the quick and easy identification of genes required for the regeneration of larval tissues as well as other physiological phenomena regulating tissue homeostasis after embryogenesis. Therefore, this delivery method provides a currently needed strategy for temporal control to the evaluation of gene function after embryogenesis.&#160;

An adaptable reverse genetic method for zebrafish to assess gene function during later stages of development and physiological homeostasis such as tissue regeneration using intraventricular injections of gene-specific morpholinos.

Reverter Genética Abordagem Morfolino Usando Injeção Cardíaca Ventricular para transf múltiplos tecidos de difícil alvo do Zebrafish Zergling

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Usando o rato do mamárias Células Tumorais para ensinar Biologia Conceitos Básicos: A Módulo Lab Simples

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Usando Caco-2 em células para estudo LIPID Transportes pelo intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucina Agarose Gel Eletroforese: Western Blotting para glicoproteínas alta peso molecular


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Destacamento de Cientistas Comunitários para Realizar Amostragem Genética Não Destrutiva de Populações de Borboletas Raras

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Isolamento e Perfil de Núcleos Únicos de Tecidos de Mamíferos Congelados

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Autor em destaque: Aprimorando a descoberta de medicamentos - Desenvolvimento de protocolos automatizados e padronizados para extração de núcleos de tecidos congelados 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único