Yazarlar Tavuk dokuları yardım ettikleri için Nicole M. Nemeth (University of Georgia) ve Jeanne M. Fuarı (LANL) teşekkür ve çekimler sırasında, onun yardım için Steven A. Springer olurdu. Bu çalışmada tüm kuşların bakım Los Alamos Ulusal Güvenlik, LLC, Los Alamos operatörün Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış laboratuvar hayvanları ve tüm protokolleri insani kullanımı için Sağlık kuralları National Institutes uygun oldu Sözleşme kapsamında Ulusal Laboratuvarı ABD Enerji Bakanlığı ile No DE-AC52-06NA25396. Bu çalışmada farelerde bakımı UCSD hayvan onaylanan protokole uygun olduğunu. İnsan doku UCSD onaylı protokol IRB bir parçası olarak elde edildi. Bu çalışma California Lab Ücret Başkan Programı Üniversitesi (PG) ve hibe NS047101 Nörolojik Bozukluklar Ulusal Enstitüsü ve İnme (Nörobilim Mikroskopi Paylaşılan Tesisi, UC San Diego) hibe 118645 tarafından desteklenmiştir.

1. OCT Doku Gömme <ol><li> Sığ bir strafor kutuda 2-metil bütan için kuru buz ekleyerek dondurma banyo hazırlayın. </li><li> Doku Harvest, yavaşça aşırı sıvı kurulamak için kağıt mendil üzerine nemli. Ek dondurulmuş doku (sıvı nitrojen içinde dondurulmuş doku) kullanıyorsanız, doku kriyo-mikrotom odasında yerleştirerek -20 ° C&#39;ye kadar ısınmasını bekleyin. </li><li> Yeterli kalıbın alt kapağı, Peel-A-Way donma kalıp eki küçük bir miktar ekleyin. </li><li> Kalıp içinde doku yerleştirin, doku istenen yönde de kalıbın tabanındaki üzerinde duran olduğundan emin olun. Bir kez dondurulmuş doku blok veya alt taraftan ya da kesit olacaktır. </li><li> OCT doku kapağı, ve dondurma banyo içinde kalıp yerleştirin. Doku dondurur OCT bileşiği beyaz dönecek. </li><li> Sonra belirgin bir dondurma torba içinde dondurulmuş blok ve kapalı yerde kalıp soyma, dondurulmuş. </li><li> Dondurulmuş bloklar tutulabilir-80 ° C&#39;ye kadar. </li></ol> 2. Kesit Doku <ol><li> Sıra doku kriyo-mikrotom odasında blokları ve bunların -20 ° C (yaklaşık 30 dk) ulaşmanızı sağlar. </li><li> Bir 3-5 mikron kalınlığında kesit Kes ve bölümün üstünde bir pozitif yüklü cam slayt yerleştirin. Doku slayt uyacaktır. </li><li> Hava 30-60 dakika süreyle doku kurulayın. </li><li> Slaytlar, bu aşamada kullanılabilir, ya da -80 ° C &#39;de gelecekte kullanılmak üzere muhafaza edilebilir. </li></ol> 3. Boyama Doku <ol><li> -80 Bekletildi Slaytlar ° C: slaytlar 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kuru bir çözülme ve hava sağlar. </li><li> % 10 oranında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tamponlu formalin ile slaytlar düzeltildi. </li><li> 250 ml tampon içinde slaytlar 10 kez daldırma her bir yıkama için, PBS veya TBST tamponu içinde üç kez yıkanır. PBS tamponu fosfataz, kromojenik conjug Alkalin ile tespiti için, ancak, immunofloresans boyaması için kullanılabilirlerantikor ated, TBST PBS içinde fosfat beri kullanılması gerektiğini Alkalin fosfataz aktivitesini inhibe eder. </li><li> Doku kesitleri slaytlar artık lekeli hazırdır. </li></ol> 4. Mukus Algılama böyle Alsiyan Mavi ve Periyodik Asit Schiff gibi Histokimyasal Boyaları Kullanımı <ol><li> Alsiyan Mavi lekesi: <ol><li> Su içinde slaytlar durulama, oda sıcaklığında 3 dakika için% 3 asetik asit içinde inkübe edilir. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika için Alsiyan Blue pH 2.5 çözeltisi ile Leke. </li><li> 10 dakika süreyle akan su içinde yıkayın slaytlar, DI su ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca Nükleer Hızlı Kırmızı Counterstain. </li><li> Yıkama distile su içinde üç kez kayar. </li></ol></li><li> Periyodik Asit Schiff boyası: <ol><li> Su içinde slaytlar durulayın, 5 dakika için taze hazırlanmış% 1 periyodik asit içinde inkübe edilir. </li><li> DI suyla üç kez yıkayın, bir kez miliQ suya batırın. </li><li> Oda sıcaklığında, 15 dakika süre ile Schiff reaktif Lekee. </li><li> 10 dakika süreyle akan su içinde yıkayın slaytlar, DI su ile durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 sn için Surgipath hematoksilin Counterstain. </li><li> Yıkama distile su içinde üç kez kayar. </li><li> İnkübasyon oda sıcaklığında Scott musluk suyu içinde 30 saniye kayar. </li><li> DI suyla üç kez yıkayın. </li></ol></li><li> Kurutmak ve% 100 etanol içinde üç hızlı değişiklikler ve Citrisolv üç değişiklikler, 2 dakika her biri, ardından% 95 etanol içinde 1 dakika inkübe edilerek slaytlar temizleyin. Oda sıcaklığında tüm. </li><li> Reçineli orta (Cytoseal 60) lamelleri üzerine slaytlar monte edin. </li></ol> 5. Histokimyasal Yöntemlerle glukanıdır epitoplar Algılama Lektinlerle ve Antikorlar (Tablo 1) kullanarak <ol><li> Lektin kullanarak üç glikan epitopunun floresans saptama için, oda sıcaklığında, 10-30 dakika boyunca PBS içinde% 1 BSA ile bloke slaytlar. </li><li> Bir biyotinile lektin kullanıldığı için,% 0.1 ile 15 dakika inkübe edilerek endojen biyotin engellemekAvidin, oda sıcaklığında% 0.01 biotin ile 15 dakika inkübe edildi. </li><li> Her engelleme adımdan sonra PBS slaytlar yıkayınız. </li><li> Taze 1 ug / ml Rodamin-konjuge succinylated buğday tohumu aglutinin (sWGA), 1.3 ug / ml biyotinile Sambucus nigra agglutinin (SNA) ve 5 mg / HEPES / ml NaCl tampon içinde floresein-konjuge Jacalin (10 mM HEPES, bir karışım hazırlamak 150 mM NaCl, pH 7.5). </li><li> Düz bir yüzeye veya bir boyama kutusu ve katman üstüne lektin karışımı koyun slaytlar. Karışım yavaşça hacim sıvı üzerinde parafilm yerleştirilerek azaltılabilir, parafilm sıvı düzleştirir ve buharlaşmasını önler. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> Yıkama üç kere PBS ile kayar. </li><li> 0.7 mg / ml streptavidin-konjuge CY5 (biyotinile-SNA tespit etmek için), ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir ve tabaka ile kayar. </li><li> Yıkama üç kere PBS ile kayar. </li><li> 0.1 &amp; m çekirdekler Counterstainu, g / ml DAPI. </li><li> VectaMount montaj ortam (veya herhangi bir sulu ortam) olarak, örneğin sulu ortam ile lameller üzerine monte slaytlar. </li></ol> 6. Lektin Boyama Özgünlük için denetleme <ol><li> Lektin boyama özgüllük boyamadan önce hedef glikan epitopun belirli enzimsel bölünme ile ya da küçük moleküller ile rekabet tarafından kontrol edilir. </li><li> Sambucus nigra aglutinin (SNA) bağlama özgünlüğü için Enzimatik dilinim <ol><li> 250 50 mM sodyum asetat pH 5.5 mU / ml Arthrobacter ureafaciens siyalidaz (AUS) seyreltin. </li><li> Öneri kutusu boş altına su ekleyin, bu inkübasyon sırasında nemli odasına oluşturacaktır. </li><li> Sıra kaydıraklı bir lamel ile slayt ve kapak üzerinde ucu kutusu, katman 150-200 ul AUS çözüm üst tabla üzerine yerleştirin. Hava kabarcığı oluşumunu önleyiniz. </li><li> 2.5 saat için 37 ° C sıcaklıkta inkübe kutusu kapağı ve kapatın. </li><li> Yıkama odasında temper de PBS içinde üç kez slaytlartüm ücretsiz sialik asit kaldırmak için düs ük. Bu slaytları SNA boyanması için negatif olması gerekir. </li></ol></li><li> Jacalin ve succinylated buğday tohumu aglutinin (sWGA) özgüllük için Rekabetçi inhibitörler <ol><li> Lektin karışımın tablet 200 ul 5.4 adım için iki Eppendorf tüpleri içinde hazırlanır. </li><li> Diğer şişeye 1:10 seyreltme de şişeleri ve Chitin-hidrolisat (sWGA inhibitörü) biri 200 mM melibiyoz (Jacalin inhibitörü) ekleyin. </li><li> Bindirme negatif kontrol slaytlar inhibitörleri içeren slaytların geri kalanı ile aynı zamanda oda sıcaklığında inkübe edin ve karışımı 1 saat. Bu slaytları sırasıyla, Jacalin veya sWGA boyama için negatif olması gerekir. </li></ol></li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Kriyo-koruyan medya (OCT) gömülü dondurulmuş dokulara parafine gömülü doku örnekleri arasında bir karşılaştırma Muci için boyama korunması ve kalitesi çarpıcı farkı ortayan glikoproteinler. Böyle Alsiyan Mavi ve Periyodik Asit Schiff gibi histokimyasal boyalar ile Doku boyama dondurulmuş ya da parafine gömülü örnekleri (Şekil 1) karşılaştırılabilir doku kesitlerinde çok farklı sonuçlar üretebilir. Görünüşe göre organik çözücü parafin gömme işlemi sırasında kullanılır ki (ksilen veya Citrisolv) epithelia üzerinde salgılanan müsin dağılımı de çok numuneleri (Şekil 2) glikolipitlerin kaldırma olarak etkiler. Sonuç olarak, mukus tabaka mukoza hücreleri üzerinde daraltılmış ve çoğunlukla goblet hücrelerinde bulunan görünür. Kriyo-koruyan medya dokuların Flaş dondurma (OCT) örnek hidrasyon muhafaza ve salgılanan müsin tabakasının boyutları korunmuştur. Parafin gömme işlem benzer bir şekilde diğer mukus ile ilişkili glukanlardır ve glikolipidler etkilemiştir. Glukanıdır dağılımı bulunan epitoplara rutin glukanıdır tespiti için kullanılır lektinler, (Şekil 3) ve antikorlar kullanılarak incelendimüsin ve glikolipitler (Şekil 6). Lektin bağlayıcı iyi tanımlanmamış ve glukanlardır hem de glikan yapı 14,15 arasında uzaysal dağılımının tarafından etkilendiği için, bu lektin boyanması için uygun kontrol uygulamak için önemlidir. Enzimatik parçalanma ve yarışmalı inhibisyonu: Burada test dokulara lektin boyama kontrol etmek için iki yöntem gösterilmektedir. Glikan epitopunun Yarılma glikan-spesifik enzimler ile doku bölüm sindirilmesi ile yapılabilir, örneğin bakteri siyalidaz için SNA (Şekil 4) bağlayıcı sialik asit için kontrol olarak. Edildi Spesifik enzim (örneğin glycosidase) okudu glukanıdır epitop kaldırılması için mevcut olmadığı durumlarda, lektin özgünlüğü, sWGA boyama Jacalin boyama veya Chitin-hidrolizat için melibiyoz (Şekil 5) olarak rekabetçi bir inhibitörü ekleyerek teyit edilebilir. Biz ek dondurulmuş doku örnekleri, hangi rou olduğunu burada göstermektinely klinik ve araştırma laboratuvarlarında elde edilen, daha OCT gömülü ve müsin glikoproteinler ve onları mevcut birçok glukanlardır incelemek için kullanılabilir. <table border="1"><tbody><tr><td> Lektin / Ab </td><td> Kaynak </td><td> Binbaşı özgüllük </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (Sarı slug) </td><td> Terminal Sia </td></tr><tr><td> MAA * </td><td> Maackia amurensis (Amur Maackia) </td><td> Galβ1-R Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-sülfat </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (Mürver) </td><td> Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc </td></tr><tr><td> WGA </td><td> Triticum vulgaris (Buğday) </td><td> GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Succinylated Triticum vulgaris (Buğday) </td><td> GlcNAc &amp; beta, 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> PNA </td><td> Arachis (Yerfıstığı) </td><td> Galβ1-3GalNAc (değiştirilmemiş T-antijen) </td></tr><tr><td> Jacalin </td><td> Artocarpus integrifolia (Jacalin) </td><td> Galβ1 3GalNAc-O-bağlı glukanlardır bulunabilir </td></tr><tr><td> ECA </td><td> Erythrina cristagalli (Mercan ağacı) </td><td> Galβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> Antikor </td><td> O-bağlı glukanlardır üzerine Siaa2-6GalNAc (STN) </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> Antikor </td><td> Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLE) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> Antikor </td><td> Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (SLE x) </td></tr></tbody></table> Kısaltmalar: Ab, antikor; Sia, Sialik asit; Gal, Galaktoz; GalNAc, <em&gt; N-acetylgalactosamine, GlcNAc, N-asetilglukozamin; fuc, fucose; STN, Sialyl Tn, SLE, sialyl Lewisa, SLE, x, sialyl Lewis x. MAA için * Ticari kaynaklardan Mali, MALII ve MAH içerir. Tablo 1. Glukanıdır epitopları için lektinler ve antikorların kısmi listesi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> Şekil 1. Alsiyan Mavi ve dondurulmuş ve parafine gömülü kolon dokularında Periyodik Asit Schiff boyası. Insan, fare veya tavuk kolon örneklerinin doku kesitleri OCT (üst panel) dondurulmuş veya parafin (alt panel) gömülü Periyodik Asit Schiff (PAS) ile boyandı ya Alsiyan Mavi (AB). Bu reaktifler sırasıyla, pembe ya da mavi mukus leke. Üst panel: dondurulmuş doku olarak, goblet hücrelerinde müsin ek olarak, mukus salgılanması ayrıca kuvvet idiible (oklar). Alt panel: parafine gömülmüş doku, mukus boyama goblet hücreleri ile sınırlı idi. Çekirdekler Surgipath (PAS) veya Mayer&#39;in (AB) Hematoksilen ile zıt edildi. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> Şekil 2. % 10 tamponlu formalin ve sulu (sol panel) muhafaza içinde müsin önemli kaybına Citrisolv kuluçka sonuçlar. Dondurulmuş tavuk ileum örnekleri Seri kesitler sıralı% 70 inkübasyon,% 90 ve% 100 etanol ile etanol içinde suyu 20 dakika süreyle, fikse edildi Her (orta panel) veya etanol içinde susuz ve 1 saat (sağ panel) Citrisolv ile temizlenir. Dehydrated örnekleri Hematoksilen-Eozin (H &amp; E) veya Alsiyan Blue boyaması önce PBS geri rehidrate edildi. Etanol dehidratasyon ve Citrisolv takas gelişmiş doku morphology (örneğin, üst satır, orta ve sağ görüntüleri veya sol resim). Etanol dehidratasyon Alsiyan Blue boyaması (orta sıra, sol ve orta görüntüleri karşılaştırın) üzerinde anlamlı bir etkisi vardı. Buna karşılık, Citrisolv inkübasyon Alsiyan Blue boyaması azalır ve parafine gömülü dokularda (Şekil 1) görülene benzer bir desen goblet hücreleri (orta sıra, sağ resim) için sınırlı. Bu veriler parafine gömülü örneklerinde mukus granülleri kuvvetli boyanma takas adımı sırasında küçülen ve goblet hücrelerinde mukus yoğuşmalı bağlı olduğunu göstermektedir. Dondurulmuş OCT-gömülü dokularda mukus sönük ve az yoğun boyama doku mukus daha doğal dağılımını yansıtmaktadır. Kutulu alanlardan yüksek büyütme oklarla işaretlenmiştir. Ölçek çubukları 50 mikron (üst ve orta satırlar) ve 10 mikron (alt satır) gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bağlanmadondurulmuş ve parafine gömülü dokularda glukanıdır epitoplara lektinler. Tavuk ince bağırsak (ileum) örneklerinde OCT (üst panel) dondurulmuş veya Jacalin (mavi), sWGA (yeşil) ve SNA ile probed (alt panel) parafine gömüldü (kırmızı ). Kutulu alanlardan yüksek büyütme oklarla işaretlenmiştir. Dondurulmuş dokularda O-bağlı glukanlardır bağlama Jacalin lümen (Jacalin, üst panel, oklar) içine goblet hücrelerinden sızıntı ortaya çıktı yapıları ortaya çıkarmıştır. Buna karşılık, parafine gömülü dokularda bağlama Jacalin goblet hücreleri (Jacalin, alt panel, oklar) ve villus fırça sınır (sol alt resim, ok) ile sınırlı idi. β1-4GlcNAc arasında sWGA boyama kısmen de dondurulmuş dokularda Jacalin lektin bağlayıcı (üst panel, oklar) ile birlikte lokalize ve dokuların (alt panel, oklar) parafine gömülü. Buna karşılık, α2-6 bağlantılı sialik asit bağlayıcı SNA lektin (SNA, ok uçları) hücre içi ve Jacalin (renk ile birlikte lokalize etmezkırmızı görüntü, SNA ok ucu, noktalı ok işaretli mavi Jacalin) ile işaretlenmiş. Ölçek çubukları 100 mikron (sol resim) ve 20 mikron (büyütülmüş kutulu alanlar) gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> Şekil 4. SNA ile sialik asit boyama için enzimatik bölünme kontrolü. Tavuk ince bağırsak numuneler 37 ° C sıcaklıkta 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens siyalidaz (Avustralya) ile 2.5 saat boyunca ya da 50 mM sodyum asetat pH 5.5 tamponu ile inkübe edildi AUS tedavi sialik asidin SNA bağlama özgünlüğü teyit biotinlenmiş SNA ile boyanarak ortadan kaldırmaktadır. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> Şekil 5,. Jacalin ve sWGA glikan ile boyanması için Rekabetçi inhibisyon kontrolü. Tavuk ince bağırsak (kıvrımbağırsak) örnek spesifik LEC varlığında bir Jacalin ve sWGA karışım ile inkübe edildikalay inhibitörleri: melibiyoz (orta sütun), Chitin-hidrolizat (sağ sütun) veya inhibitör olmadan (A ve D). Üst panel: (solda) inhibitörleri olmadan Jacalin boyama. (Merkezi) Jacalin boyama melibiyoz tarafından inhibe edilmiştir. (Sağda) Chitin-hidrolizat Jacalin boyama inhibe etmemiştir. Alt panel: (solda) inhibitör olmadan sWGA boyama. (Merkezi) melibiyoz sWGA boyama inhibe etmemiştir. (Sağda) sWGA boyama Chitin-hidrolizat tarafından inhibe edilmiştir. Bu inhibisyon dokuları ile lektinlerinin spesifik etkileşimi teyit etmektedir. Boyama inhibisyon Asteriskler imajının. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> Şekil 6. Sekretuar müsin, glikolipid ve donmuş insan kolorektal kanser dokularında glukanıdır epitopların tespiti. Villöz karsinom ve mukoza karsinom Kolorektal kanser biyopsi sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve OCT gömülü. Doku kesitleri 1 saat süreyle inkübe edildisalgılanan musin karşı antikorlar ile MUC5AC sialyl Lewis - glukanıdır epitop gangliosides (kolorektal kanser belirteci CA 19-9) üzerinde bulunan ve sialyl-Tn - müsin üzerinde bol glukanıdır epitopu (TKH2 antikor ile tespit) ile 30 dakika inkübasyon izledi biyotinile eşek anti-fare IgG ikincil antikor, ve peroksidaz-konjuge streptavidin ile 30 dakika inkübasyon. İlave doku peroksidaz-konjuge streptavidin ile 30 dakika inkübasyon, ardından biyotinile lektinler SNA ve sWGA ile 1 saat boyunca inkübe edildi. Peroksidaz boyama AEC kiti kullanılarak geliştirilmiştir. Siyah ölçek çubuğu 200 mikron gösterir.

<ol>
	<li>Slayter, H. S., Wold, J. K., Midtvedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucin+of+germ-free+rats.+Biochemical+and+electron-microscopic+characterization.">Intestinal mucin of germ-free rats. Biochemical and electron-microscopic characterization.</a> Carbohydr. Res. 222, 1-9 (1991).</li><li>Lamblin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate+diversity+of+human+respiratory+mucins:+a+protection+of+the+underlying+mucosa.">The carbohydrate diversity of human respiratory mucins: a protection of the underlying mucosa.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 144, S19-S24 (1991).</li><li>Corfield, A. P., Carroll, D., Myerscough, N., Probert, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+gastrointestinal+tract+in+health+and+disease.">Mucins in the gastrointestinal tract in health and disease.</a> Front. Biosci. 6, D1321-D1357 (2001).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+front+line+of+enteric+host+defense+against+unwelcome+intrusion+of+harmful+microorganisms:+mucins,+antimicrobial+peptides,+and+microbiota.">The front line of enteric host defense against unwelcome intrusion of harmful microorganisms: mucins, antimicrobial peptides, and microbiota.</a> Clin. Microbiol. Rev. 19, 315-337 (2006).</li><li>Kim, Y. S., Ho, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+goblet+cells+and+mucins+in+health+and+disease:+recent+insights+and+progress.">Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 12, 319-330 (2010).</li><li>Nochi, T., Kiyono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+the+mucosal+immune+system.">Innate immunity in the mucosal immune system.</a> Curr. Pharm. Des. 12, 4203-4213 (2006).</li><li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+airway+epithelium:+soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses.">The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin. Microbiol. Rev. 24, 210-229 (2011).</li><li>McGuckin, M. A., Linden, S. K., Sutton, P., Florin, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucin+dynamics+and+enteric+pathogens.">Mucin dynamics and enteric pathogens.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 265-278 (2011).</li><li>Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+clearance+as+a+primary+innate+defense+mechanism+for+mammalian+airways.">Mucus clearance as a primary innate defense mechanism for mammalian airways.</a> J. Clin. Invest. 109, 571-577 (2002).</li><li>Johansson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inner+of+the+two+Muc2+mucin-dependent+mucus+layers+in+colon+is+devoid+of+bacteria.">The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15064-15069 (2008).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Hayat, M. A., Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy. , 53-70 (2002).</li><li>Cohen, M., Hurtado-Ziola, N., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABO+blood+group+glycans+modulate+sialic+acid+recognition+on+erythrocytes.">ABO blood group glycans modulate sialic acid recognition on erythrocytes.</a> Blood. 114, 3668-3676 (2009).</li><li>Cohen, M., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sialome--far+more+than+the+sum+of+its+parts.">The sialome--far more than the sum of its parts.</a> OMICS. 14, 455-464 (2010).</li><li>Ota, H., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+laminated+array+of+two+types+of+mucin+in+the+human+gastric+surface+mucous+later.">Alternating laminated array of two types of mucin in the human gastric surface mucous later.</a> Histochemical J. 24, 86-92 (1992).</li><li>Matsuo, K., Ota, H., Akamatsu, T., Sugiyama, A., Katsuyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+of+the+surface+mucous+gel+layer+of+the+human+colon.">Histochemistry of the surface mucous gel layer of the human colon.</a> Gut. 40, 782-789 (1997).</li><li>Boyde, A., Maconnachie, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+lithium+salts+reduces+ethanol+dehydration+shrinkage+of+glutaraldehyde+fixed+tissue.">Treatment with lithium salts reduces ethanol dehydration shrinkage of glutaraldehyde fixed tissue.</a> Histochemistry. 66, 181-187 (1980).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dondurulmuş dokularda mukus ve glukanıdır epitoplarının korunması parafine gömüldü dokuların üstündür. Bu mukus salgılanması katman (Şekil 1 ve 3) ve parafine gömülmüş dokulara göre dondurulmuş dokuda üç glukanlardır yapılarının dağılımı (Şekil 3) arasında muhafaza göstermiştir. Bu tür Carnoy çözeltisi gibi özel fiksatifler, (% 60 etanol,% 30 kloroform,% 10 asetik asit) 17 doku numuneleri içinde mukus tabakasının en uygun şekilde korunması için geliştirilmiştir. Optimal, bu çözüm mukus çalışmalar için varız doku örnekleri toplamak için kullanılması gerektiğini ve mukus tabakası 16-17 pürüzsüz bir görünüm korumak için gösterilmiştir. OCT gömülü sabitlenmemiş donmuş örnekleri mukus tabakası sağlam görünür ve bazı alanlarda doku ayırmak olabilir, ancak genel tabakası kalınlığı Carnoy solüsyonu ve embedd ile tespit edilen dokularda gözlenen ile uyum içindedirParafin 16-17 ed. 16 - Örneğin, dondurulmuş insan kolon dokusunda bölümünde mukus tabakası Carnoy&#39;s sabit insan kolon Örnek 55.4 ± 2.5 mikron (204.8 mikron aralığında 7.7) için bildirilen aralığında ~ 100 mikron (Şekil 1) &#39;dir. Bu, on yıllardır bilinmektedir ki biyolojik numune, 18 ~% 30 büzülme ve dokular 13 ksilen gibi organik çözücüler, Citrisolv ve bir dereceye kadar kloroform ekstresi lipidler, glikolipidler ve, proteinler de etanol dehidrasyon ile sonuçlanır. Fiksasyon (% 10 tamponlu formalin), dehidratasyon (artan etanol konsantrasyonu) ve takas (Citrisolv veya ksilen): parafine gömme için Doku işlem aşağıdaki adımları içerir. Sabitlenmemiş dondurulmuş doku kesitlerinde şu adımları taklit ederek, biz Citrisolv (Figür parafine gömülü dokuların buna benzer doku morfolojisi sonuçlanan dondurulmuş doku bölümlerden mukus ayıklar göstermiştire 2, sağ panel). Buna karşılık, mukus katman (Şekil 2, sol ve orta panel) ya da formalin etanol ile inkübasyon yoluyla değişmemiştir. Bu da gösteriyor ki Citrisolv / ksilen uzamış inkübasyon gerektirir standart parafine gömme prosedürün açıklığa adım, mukus tabakasının çöküşle sonuçlanır. Formalin fiksasyonu kolayca glikan, lipid glikolipitler ve proteinler (Şekil 2, 3 ve 6) karşı lektinler ve antikorlar ile boyanarak edilebilir formalin ile tespit edildi mukus tabakası ve dondurulmuş doku bölümleri zarar vermez. Bu etkiler membrana bağlı proteinler ve doku patolojisinin çalışma için önemsiz olabilir, ama bu tür salgılanan mukus tabakası gibi yüksek nemli yapılar için yıkıcı vardır. Müsinlerin Ancak histolojik çalışmalar hala mukus tabakası korunması suboptimal olduğu parafine gömülü örnekleri, çoğunlukla yapılır. Böyle se kesin kimlik olarak mukus tabakası kompozisyon derinliği analizlerindecreted ya da zar bağlı glikoproteindir MUC kombinasyonları spesifik antikorlar ve protein omurgaları belirlenmesi için kütle spektrometrisi gerektirir. Mukus tabakasının korunması gibi çalışmaları için ancak ilk gerekliliktir. Birçok laboratuar farklı projeler için geçmişte toplanmıştır OCT dondurulmuş doku örneklerinin, bu dokular kolayca müsin, glikolipid ve mukus korunması için benzersiz tasarlanmış özel fiksatif içine dokuları toplamak için ihtiyacı ortadan kaldırarak glukanıdır dağılımını kullanılabilir olması. Donmuş dokular en az işleme geçmesi ve bu yüzden doğal olarak sulu glikan, lipid doğal dağılımı muhafaza edilir. Bu mikrobiyal-konak ilişkileri aleminde özellikle önemlidir. Bu &quot;bariyer&quot; molekülleri dekorasyon salgılanan müsin ve birçok glukanıdır yapıların natüralist dağılımı ve bolluğu Bilgi konak savunma, mikrobiyal sömürü ve patojenler anlamada anahtar olacakolduğunu.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 2-metil bütan </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> AEC peroksidaz substrat kiti </td><td> Vektör Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alsiyan Mavi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Anti-CA 19-9 monoklonal antikor </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Anti-MUC5AC monoklonal antikor </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidin-Biotin engelleme kiti </td><td> Vektör Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biyotinile eşek anti-fare antikoru </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> Biotinlenmiş SNA </td><td> Vektör Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Sığır sedk </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Chitin-hidrolizat </td><td> Vektör Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Kriyostat mikrotom </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Hematoksilen </td><td> Surgipath Medikal Sanayi </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> Hidrojen peroksit% 30 </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalin-FITC </td><td> Vektör Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Mayer Hematoksilen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiyoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Nükleer Hızlı Kırmızı </td><td> Vektör Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> Ekim bileşik </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Peroksidaz bağlı streptavidin </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Schiff reaktifi </td><td> Elektron mikroskobu bilimler </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rodamin </td><td> Vektör Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 monoklonal antikor </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount sulu montaj medya </td><td> Vektör Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Peel-A Way kalıpları </td><td> Polysciences A.Ş. </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

using unfixed, frozen tissues to study natural mucin distribution

Mukinler ağırlığı 1-3% 70&#39;den fazla karbonhidrat içeren karmaşık ve ağır glikosilatlıdır O-bağlı glikoproteinler, vardır. Salgılanan müsin, goblet hücresi ve mide mukozası tarafından üretilen, bir mikrometre kalınlığında mukus tabakası için iskele sağladığı hatları bağırsak ve solunum yolu 3,4 epithelia. Müsin ek olarak, mukus tabakalar da antimikrobiyal peptitler, sitokinler ve immünoglobulinler 5-9 içerir. Mukus tabakası konak bağışıklık önemli bir parçası olduğunu ve mikroorganizmaların 8,10-12 istila karşı ilk savunma hattı oluşturur. Bunun gibi, mukus mikropların çok sayıda etkileşimleri tabidir, hem patojenler ve simbiont ve salgılanan müsin bu etkileşimler için önemli bir arayüz oluştururlar. Böyle biyolojik etkileşimin çalışma genellikle doku toplama ve boyama için histolojik yöntemler içerir. Doku toplama ve preserv için iki en yaygın olarak kullanılan yöntemler histolojikklinik ve araştırma laboratuvarlarında ation şunlardır: formalin fiksasyonu kriyo-koruyan medya gömerek ardından, parafine gömme takip ve doku dondurma. Parafine gömülü doku örneklerinde berraklık ve iyi tanımlanmış morfolojisi gibi histolojik görselleştirme için optimal nitelikler ile bölümleri üretmek. Bununla birlikte, parafin gömme işlemi sırasında epitopunun çok sayıda değiştirilmiş ve bu epitoplara incelemek için, doku kesitleri daha fazla sayıda epitop yöntemlerine de 13 biri ile işlenmesi gereken hale gelir. Salgılanan müsin ve lipitler organik çözücü maddeler (ya da ksilen Citrisolv) ile inkübasyon uzun sürmesi parafin gömme temizleme adımı sırasında doku ayıklanır. Bu nedenle bu yaklaşım müsin ve in vivo mukus niteliği ve dağıtım odaklanan çalışmalar için optimal olduğunu. Buna karşılık, Optimal Kesme Sıcaklık donma dokuların (OCT) orta bir katıştırmaboşluklar örnek dehidratasyon ve takas ve örnek hidrasyon korur. Bu mukus sulu tabaka daha iyi koruma sağlar, ve böylece epitel biyoloji Müsinlerin çok sayıda rolleri çalışma sağlar. Bu yöntem, doku en az işleme gerektirdiği gibi, doku daha doğal bir durumda muhafaza edilir. Dolayısıyla dondurulmuş doku bölümleri boyamadan önce herhangi bir ek işlem gerektirmez ve kolayca immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak analiz edilebilir. Biz dondurulmuş kolon örneklerinde mikrometre kalınlığında salgılanan mukus tabakasının korunması göstermektedir. Aynı dokularda parafin içine gömülmüş, bu katman büyük ölçüde azaltılmış olur. Ayrıca bitki lektinler kullanarak müsin sunulan glukanıdır epitopların immünofloresan boyama göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı, özel fiksatif kullanımını gerektirir ve zaten laboratuvarda muhafaza edilebilir dondurulmuş doku kullanan veriyor olmamasıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution at JoVE.com

Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Optimal Kesme Sıcaklık orta (OCT) gömülü sabitlenmemiş dondurulmuş doku örneklerinin salgılanan mukus doğal dağıtım ve glikozilasyon incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, doku işleme minimal ve glikolipitler, müsin ve glukanıdır-epitopların doğal sunumu korunur. Doku kesitleri floresan veya kromojenik algılama kullanılarak immünohistokimyasal olarak analiz edilebilir.

Doğal Müsin Dağıtım Eğitim için sabitlenmemiş, Dondurulmuş Dokular kullanma

Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by ...

using-unfixed-frozen-tissues-to-study-natural-mucin-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

47.5K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Optimal Kesme Sıcaklık orta (OCT) gömülü sabitlenmemiş dondurulmuş doku örneklerinin salgılanan mukus doğal dağıtım ve glikozilasyon incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, doku işleme minimal ve glikolipitler, müsin ve glukanıdır-epitopların doğal sunumu korunur. Doku kesitleri floresan veya kromojenik algılama kullanılarak immünohistokimyasal olarak analiz edilebilir.

Video: Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Bilgisayar oluşturuldu Hayvan Modeli Uyaranlar

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Zebrafish görme fonksiyonu çalışma optokinetik yanıt

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to employ reverse genetics have not yet been adequately developed to assess gene function in regeneration or tissue homeostasis during larval stages after zebrafish embryogenesis, and several tissues within the zebrafish larva are difficult to target. Intraventricular injections of gene-specific morpholinos offer an alternative method for the current inability to genomically target zebrafish genes in a temporally controlled manner at these stages. This method allows for complete dispersion and subsequent incorporation of the morpholino into various tissues throughout the body, including structures that were formerly impossible to reach such as those in the larval caudal fin, a structure often used to noninvasively research tissue regeneration. Several genes activated during larval finfold regeneration are also present in regenerating adult vertebrate tissues, so the larva is a useful model to understand regeneration in adults. This morpholino dispersion method allows for the quick and easy identification of genes required for the regeneration of larval tissues as well as other physiological phenomena regulating tissue homeostasis after embryogenesis. Therefore, this delivery method provides a currently needed strategy for temporal control to the evaluation of gene function after embryogenesis.&#160;

An adaptable reverse genetic method for zebrafish to assess gene function during later stages of development and physiological homeostasis such as tissue regeneration using intraventricular injections of gene-specific morpholinos.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Çekirdek Biyoloji Kavramları öğretmek için Fare Meme Tümör Hücreleri kullanma: Basit Lab Modülü

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Musin Agaroz jel elektroforezi: Yüksek molekül ağırlıklı glikoproteinler için Western Blot


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Nadir Kelebek Popülasyonlarının Tahribatsız Genetik Örneklemesini Yapmak için Topluluk Bilim Adamlarını Görevlendirmek

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu ve Profillenmesi

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Yazar Spotlight: İlaç Keşfinin Geliştirilmesi - Donmuş Dokulardan Çekirdek Ekstraksiyonu için Otomatik, Standartlaştırılmış Protokollerin Geliştirilmesi 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.