我々は、技術的な支援をTzlil Rozenblat、アレクサンドラ·ベロとカールシュピュラーに感謝します。この作品は、ヴァッサー大学学部研究サマー·インスティテュート（URSI）、ルーシー·メイナード·サーモン研究基金と米航空宇宙局（NASA）受賞＃NX09AU90A、科学技術の研究の卓越性のための国立科学財団センター（NSF-CREST）受賞＃0630388およびNSFによってサポートされていました賞＃1058385。

1℃、ビデオ解析のためのエレガンス準備<ol><li>薄い、平らに白金線のピックを使用して新鮮なNGM寒天で満たされたペトリ皿に10-20妊娠成人虫を移動します。 NGM寒天でいっぱいペトリ皿は、 大腸菌の小さな円形のスポットを含む食べるために線虫用の大腸菌 （限られた成長株、OP50は、最良の結果を与える。）線虫は3-5時間の卵を産むことを許可してから、このようにして50から150線虫の小、発生的に同期化された文化を確立し、成人を削除します。線虫は4-5日間20℃ペトリプレートをインキュベートすることによって、成人早期に成長することができます。これらの培養方法は確立された手順（Stiernagle 2006）に基づいています5 </li><li>ビデオ分析の日に、このように同期化された文化50から150ワームを集め、脱イオン蒸留水1mlで若い成人線虫のプレートをフラッシュします。 M9またはPBSのような緩衝液を使用することもできます。ワットをスピンさせて遠心を使用チューブの底にオームズ、またはそれらを約15分間、重力によって沈降することができます。管からの水の大部分を除去し、線虫から任意の付着細菌を洗い流すために、脱イオン蒸留水1mlに交換してください。 </li><li>マイクロピペットを用いて石英キュベットに水または緩衝液で線虫を転送します。一度に1線虫は、レーザーで照らされる可能性があるように、それは1時間またはそれより少ない時、合計で5月10日線虫について、少人数で業務を進めることが重要である。培養プレート上に線虫の数が多すぎる場合は、所望の濃度に達するまで水または緩衝液中にワームを希釈します。それはそれらを洗うとキュベットに個別のワームを転送するために新鮮な寒天プレートに水または緩衝液の一滴まで個々の線虫を選ぶことも可能です。私たちの研究では、行動を泳いで物理的な制約の効果を調べるために1ミリメートル、2ミリメートルと5ミリメートルキュベットサイズを使用しました。 </li></ol> 2。ビデオAnalysi用の光学セットアップの<ol><li>できる543 nm（緑）ヘリウム-ネオン（ヘリウムネオン）レーザ、2つのフロント表面アルミニウムミラー、キュベットホルダ、投影スクリーン、高速カメラ（カシオハイスピードEXILIM）を使用して、 図1に示すように、セットアップを実行〜240 fpsで撮影中。 2ミラーは、キュベットを通してレーザービームを操縦するために使用されています。キュベットの異なるサイズは、研究の性質に応じて使用することができます。例として、私たちは水泳の周波数で空間的制約の効果を示すために厚さ5mmアールキュベットを使用していました。レーザービームは、オーバーサンプリングの要件を満たさなければならない、 すなわち 、生物がレーザービームの3分の1を超えないを妨害する必要があります。 Cのそれが線虫と対話するときelegansは 、レーザビームは直径約2mmでなければなりません。回折パターンを見つけることが困難になりますので、レーザービームは、直径5ミリメートルを超えるべきではありません。画面に回折生物からの距離よりもはるかに大きくする必要があります生物そのもの。 </li><li>キュベットの上にパラフィルムを置き、水柱に線虫を混ぜて、それを反転させる。ワームは、キュベットの上部付近になるように最初にキュベットホルダーにキュベットを置きます。ミラーを使用して、キュベットの中心を通ってレーザービームを導くことができます。線虫は水よりも密度が高いので、同時に水柱内で泳いでいるうちに、彼らはゆっ​​くりと、キュベットの底に落ちるでしょう。 </li><li>送信ビームが投影画面（ 図2）を満たしているとして、投影スクリーン、色に黒透過したレーザ光 ​​に対応するスポットは、散乱を低減します。あるいは、送信ビームが画面を通過するように、投影スクリーンの開口部を置く。透過ビームからの散乱を排除または低減すること、透過ビームに起因する飽和からカメラのCCDアレイを維持します。 </li><li>回折パターンのサイズの基準をキャプチャするには、の線を引く回折光像に干渉することなく透過したレーザビームスポットの隣に投影スクリーン上に約5cm。 </li><li>部屋の明かりが5cmラインは回折像と同じ映像になるように入っているときにカメラで記録を開始します。室内灯の電源をオフにします。カメラを使用して、画面上でレコードの回折像ワームは、レーザービームを通過する。 </li></ol> 3。ビデオ·データの準備<ol><li> ：映像解析プログラム（ロガーProのインストール<a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/を</a>コンピュータ上で）。ビデオ解析プログラムにビデオをインポートする</li><li>透過したレーザスポットと一致するように原点を設定します。投写画面に5cmのラインを使用してスケールを設定します。 </li><li>ビデオ解析ソフトウェアを使用して、それぞれの線虫によって形成された回折像の角変位（ 図3）を追跡</li><li>アングラを検索するにはスプレッドシート（エクセル）にアークタンジェント（y / x）が 、コピーと貼り付けデータを取得し、継続的なグラフ（Figure. 4）を作製するために、すべての負の角度は180度またはπを追加することによりrの変位。 </li></ol> 4。スイミング周波数の即時観測のリアルタイムデータ収集<ol><li>ビデオ分析の場合と同じ設定を使用すると、投写画面の前面に回折パターンの右側の中央にある小さな領域（〜1ミリメートル2）とフォトダイオード（ThorLabsからDET10A）を置きます。 </li><li> USBポート経由でコンピュータに接続する、デジタルオシロスコープ（ピコ·テクノロジー社製PicoScope）にダイオードを接続してください。コンピュータの画面上でスラッシングパターンを観察する。 </li><li> ASCIIまたはテキスト形式で取得したデータセットを保存します。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>ビデオやカイ二乗最小化を用いたフィッティング波形のできるデータ解析プログラムにフォトダイオードを使用して取得したデータをインポートする。ここで使用されるプログラムは、（原点です<a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ）。スラッシング周波数（ 図4、図5）を決定する正弦曲線にフィット。 </li><li>平均様々な試料から水泳周波数と偏差値を算出する。この研究では、データは統計的にBonferroniの多重比較検定に続く単一因子分散分析を用いて分析した。 &lt;0.05のp値は統計的に有意であると考えられた。 </li></ol> 6。例として、Mathematicaを使ってモデルの回折パターン 注：回折パターンは多くの異なった計算ツールを使ってモデル化することができます。この手順では、このようなMATLAB、Excelなどの別の計算ツール、原産地などに異なります <ol><li> イメージを作成します：伝統的な顕微鏡を用いて顕微鏡スライド上に線虫の画像を撮影。 </li><li> 画像を2値化：輸入ワーム画像&#39;ワーム&#39; iは、Mathematicaに画像をドラッグすることにより、MathematicaはNTO。黒と白の画像（二値化）に画像を変換する。これはMathematicaで &quot;二値化&quot;コマンドを使用して達成することができます：BlackandWhiteImage =値化[ワーム]。画像は、白黒画像として表示することができます。 EdgeDetect [ワーム、6.0,0.035]、2つの末尾の数字は、結果エッジの粗さを制御：別の方法として、BlackandWhiteImageを作成するために &#39;EdgeDetect&#39;コマンドを使用します。 </li><li> 0と1の行列に画像を変換する：これは、Mathematicaで&#39;ImageDataを&#39;コマンドを使って達成することができます：マトリックス= ImageDataを[BlackandWhiteImage]。 </li><li> フーリエ変換行列：示さFourierParametersを使用して行列をフーリエ変換し、Mathematicaで&quot;フーリエ変換&quot;コマンドを使用します。FTransform =フーリエ[マトリックス、FourierParameters - &gt; {0、-2}]。 </li><li> 回折行列を取得し、画像のコントラストを向上させるための行列の広場率：絶対値の2乗行列の値と元の画像に対応する回折パターンで得られた画像を、表示します。また、画像のコントラストをスケーリングするために &quot;ログ&quot;機能を使用します。ImageContrast =イメージ[ログ[1 +（ABS ​​[FTransform]）^ 2] / 0.5]。 </li><li>クロップ中央回折パターンを、必要に応じてサイズを変更する：簡単に鑑賞するために画像のサイズを変更する ImageResize [ImageContrast [Y、100]、500]。 </li><li> 自由に泳いでワームから得られた回折パターンとモデル化された回折パターンを比較してください。 （図6） </li></ol>

<ol>
	<li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering. , (1995).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans.">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li><li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue.">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li><li>Stiernagle, T., ed, W. o. r. m. B. o. o. k. ,. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Diffraction+Analysis+and+the+Transformation+of+C.+elegans.">Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans.</a> , (2011).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotive+Analysis+of+C.+Elegans+through+Diffraction,+Control+number:+348+Session:+JTuA+-+Joint+FiO/LS+Poster+Session+I+Pres.+number:+JTuA39.">Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39.</a> , (2010).</li><li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4/MEC-10+DEG/EnaC+channel+modulates+DAF-16/FoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li><li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -. W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment.">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550 (2008).</li><li>Keller, H. E., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+Lenses+for+Confocal+Microscopy.">Objective Lenses for Confocal Microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Martin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TECHNICAL OPTICS. II, (1950).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々は。リアルタイム運動の測定と顕微鏡の使用を必要としない線虫のような微細な生物の単純な運動器官の行動への新しいアプローチを開発してきた8この方法論的アプローチは、原生生物のような多数の微細な生物を研究するために利用することができる。このメソッドは、使用する光の波長によって制限される。生物は光の波長よりも小さくするのも避けるべきでしょう。必要な機器のコスト削減と移植性に加えて、このアプローチの主要なメリットの1つは、顕微鏡下の画像平面の狭い制約を受けることなく、リアルタイムでかつ3次元で動作を測定する機能です。これは、顕微鏡ベースのアプローチを用いて研究することができません行動に対する重力やその他多数の条件の影響を調べるために、この手法でも可能です。9したがって、私たちは微生物自然歩行behaのより良い理解を得ることができます顕微鏡スライド水滴や特殊なマイクロ流体室（Park ら 、2008）の範囲から解放viors 10 回折パターンにおける位相情報の欠如は、遠方界回折パターンは、フーリエ変換の絶対値の二乗に比例するので、回折オブジェクトに対応した画像を直接検索することができません。彼らは自由に泳いで線虫（ 図6）の回折パターンと一致させることができるように我々は、したがって、ワーム画像から回折パターンを計算している。 この方法では、本当に自由で水泳の結果が得られているエレガンスとは、水または多くの異なるイオン性溶液のような光学的に透明な環境で演習その任意の微視的な種に適用することができます。従来の顕微鏡は、マイクロメートルのオーダーの焦点深度を用いた研究のみを許可。11これが限られたためである被写界深度光の焦点を合わせる： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> この回折法は、確かに従来の顕微鏡に代わるものではありませんここで、f ナンバーN（C）短い焦点距離が大きいCに関連付けられているように、 錯乱円との相互関係を持っています。12,13が、それは可能である短期間に種があっても低コストでリアルタイムに操作することができる定量的な結果を提供します。回折パターンは、任意のレーザーポインターを使って取得できます。回折パターンは、通常のデジタルカメラを用いて還元時間分解能で撮影することができます。ユーザが容易に利用可能な顕微鏡またはフォトダイオードを持っていないかもしれないが、そのようなスラッシング周波数を測定し、回折パターンを評価するように、この実験の主要な部分は、非常に低コストで完成させることができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 543 nmのHe-Neレーザ</td><td>メレスグリオ</td><td> LGX1 </td><td> 5mW未満の可視範囲内の任意のレーザを用いることができる。 </td></tr><tr><td> 2前面アルミミラー</td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td>ハイスピー​​ドEXILIMカメラ</td><td>カシオ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td> Starna細胞</td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro（ソフトウェア） </td><td>バーニア</td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematicaの8 </td><td>ウォルフラム</td><td></td><tD&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

quantitative locomotion study of freely swimming micro-organisms using laser diffraction

土壌や水生生物顕微鏡は、生きているし、複雑な3次元環境で動作します。微生物の挙動のほとんどの研究は、これとは対照的に、狭い、ほぼ2次元焦点フィールドへの移動や行動を制限する顕微鏡ベースのアプローチを使用して行われてきた。1我々はのリアルタイム分析を提供しています小説分析的なアプローチを提示自由にCを泳ぐ顕微鏡ベースの機器に依存せずに、キュベット内エレガンス 。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。私たちは、自由に泳いで線虫の発振周波数を測定する。 遠視野回折パターンの解析は、線虫の波形についての手がかりを明らかにする。回折は、オブジェクトの周りに曲げ光のプロセスです。この場合、光は生物によって回折される。光の波が干渉して、広告を形成することができるiffractionパターン。画面とオブジェクトの距離が回折物体よりもはるかに大きい場合、遠方界、またはフラウンホーファー、回折パターンが形成される。このケースでは、回折パターンは、フーリエ変換を用いて（モデル化）を算出することができる。2 C. elegansのは、三次元的に移動する自由生活土壌中に生息する線虫である。彼らは、クロールや水泳と呼ばれる別のパターンで液体で呼び出さ正弦歩行パターンにおける土壌や寒天のような固体マトリックス上で両方を移動します。機械刺激、化学感覚、および運動器官における可塑的変化を支配thermosensory細胞によって提供される感覚情報が演じる3ロールパターン内のパターンとスイッチだけ解明され始めている。私たちは顕微鏡を必要としませんし、私たちは別の共同の下に線虫の運動の複雑さを探求し始めることを可能にする三次元で線虫の運動を測定する光学的ア ​​プローチを記述する4nditions。

<html>例として、我々はCを勉強広い石英キュベット1センチ、厚さ5mmと4センチキュベットでエレガンス 。ビデオ分析を使用して単一のワームをサンプリングし、5mm厚のキュベットでのビデオ解析から得られた平均的な水泳周波数は約2.5 Hzのです（ 図4）。同様に、リアルタイムのデータ取得方法を使用して単一のワームをサンプリングし、我々はデジタルオシロスコープ（PicoScope）を使用して、約2.7ヘルツ（ 図5）の水泳周波数を得る。この手順は、多くのワームを繰り返すことができます。自由にワームを泳いでの詳細な研究は、5 mmキュベットで2.37 Hzの平均水泳頻度を明らかにした。6期待されるように、水泳周波数がクロールワーム（〜0.8 Hz）でのそれよりも高くなっています。3この回折法を用いて、 Cの平均水泳周波数顕微鏡スライドに限定されている虫は 、2Hzの以前に発行された値と一致することが判明している。1,7 ve_contentは&quot;&gt;次の手順3。）、その後6）従来の顕微鏡を用いて得られたワーム画像の助けを借りて、回折パターンを泳いでのモデリングを可能にします。モデル化された回折パターンは線虫C. elegansのスイムサイクルをシミュレートするために使用されます（ 図6）。成功したモデルでは、水泳の周波数に一致する物理的に実現可能な連続した泳ぎのパターンで構成されていますそれは水泳サイクルの初めにあったようにワームが泳いサイクルの終わりに同じ形状でなければなりません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> 図1：グリーンHeNeレーザーは、ライブCを使用して動的な回折パターンを作成するために使用されたエレガンス 。この回折パターンは240 fpsで撮影されました。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> 図2。ドラ<html>翼は黒のドットは、送信ビームの吸収を増加させる。散乱光によるカメラの彩度が低下し、回折パターンが見えるようになるされています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> 図3は、追跡されているワームの回折パターンを持つビデオ解析ソフトウェアのスクリーンショット（ロガープロ）。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> 図4、図 5 mmのキュベットで線虫のスイムサイクルに対応した映像データ。カーブフィットは〜2.5 Hzの周波数水泳を明らかにする。 &quot;/&gt; 図5。5 mmのキュベットで線虫のスイムサイクルに対応しリアルタイムデータ。カーブフィットは〜2.7 Hzの周波数水泳を明らかにする。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> 図6は、一番上の行は実際の回折パターンを表し、下の列のモデル化された回折パターンと照合されます。モデル化された回折パターンを顕微鏡スライド（中段）のワームを使用して製造した。

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Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

自由遊泳性の線虫のような微細な生物<em&gt; Cエレガンス</em&gt;住んでいると、複雑な3次元環境で動作します。我々は分析を提供斬新なアプローチを報告<em&gt; Cエレガンス</em&gt;回折パターンを使用しています。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています。

自由レーザー回折を用いた微生物水泳の定量的ロコモーションスタディ

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

quantitative-locomotion-study-freely-swimming-micro-organisms-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K ビュー.  Vassar College. 自由遊泳性の線虫のような微細な生物 Cエレガンス住んでいると、複雑な3次元環境で動作します。我々は分析を提供斬新なアプローチを報告 Cエレガンス回折パターンを使用しています。このアプローチは、キュベットを通過するレーザ光を向けることによって、生成された回折パターンの時間的な周期性を追跡で構成されています...

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

生物工学

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (&lt;$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (&lt;1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

の軸索再生を研究するために、低予算レーザー軸索切断システムの構築 C.エレガンス</em

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1.  The main difficulty of this assay ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans&#039; Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

三次元インクジェット印刷技術を用いて、ヒト軟骨組織の作製

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

ポリジメチルシロキサン（PDMS）同軸フローフォーカス・デバイスを使用したダブルエマルションの生成

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

光ファイバを用いて、液滴マイクロフルイディクスのための多色蛍光検出

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

An Efficient and Reproducible Protocol for Distraction Osteogenesis in a Rat Model Leading to a Functional Regenerated Femur

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) is a surgical technique leading to bone regeneration after an osteotomy. The osteotomized extremities are moved away from each other by gradual distraction to reach the desired elongation. This procedure is widely used in humans for lower and upper limb lengthening, treatment after a bone nonunion, or the regeneration of a bone defect following surgery for bone tumor excision, as well as in maxillofacial reconstruction. Only a few studies clearly demonstrate the efficiency of their protocol in obtaining a functional regenerated bone, i.e., bone that will support physiological weight-bearing without fracture after removal of the external fixator. Moreover, protocols for DO vary and reproducibility is limited by lack of information, making comparison between studies difficult. The aim of this study was to develop a reproducible protocol comprising an appropriate external fixator design for rat limb lengthening, with a detailed surgical technique that permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

This study describes a reproducible and detailed protocol using a newly developed external fixator for distraction osteogenesis (DO) in a femoral rat model which permits physiological weight-bearing by the animal after removal of the external fixator.

機能再生大腿骨につながるラットモデルにおける仮骨延長法のための効率的かつ再現可能なプロトコル

This protocol describes the use of a newly developed external fixator for distraction osteogenesis in a rat femoral model. Distraction osteogenesis (DO) ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

血管可視化のための二重ラスター走査光音響小動物イメージャー

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...