我々は、我々の研究室ではコラーゲン線維の研究に時間と労力を貢献したす​​べての過去に多くの学部生、大学院生やポスドクの学生に感謝したいと思います。自然科学とカナダの工学研究評議会は、継続的に当社のコラーゲン研究のための資金を提供してきました。

注：すべてのプロトコルで使用される水は比抵抗&gt; 18を有するMΩ.cm. 1。天然コラーゲン線維<ol><li>水6μlの、200mMの20μlの2 HClおよびマイクロチューブとミックスにおけるKCl 400mMの10μlを用いてpHを7に調整しHPO 4·Naを兼ね備えています。 </li><li>マイクロチューブとのミックスにコラーゲンモノマー（0.01 N HClにて〜3 mg / ml）を4μlを添加する。解決策は、無色透明であるべきである。 </li><li> ℃で、3〜4時間放置37に予め温めた熱ブロック内の反応混合物を含むマイクロチューブを置きます。この時点で、解決策は、わずかに濁って、主に天然コラーゲン線維を含んでいる必要があります。 </li></ol> 2。繊維状の長い間隔コラーゲン<ol><li>コラーゲンモノマーの1ミリリットル（0.01 N HClにて〜3 mg / ml）を、室温で24時間かけて水を4回変更すると、水400mlに対して12から14 kDaのMWCO膜を使用して透析する。透析しcollagすぐに使用されていないエンモノマーは4℃で、将来の使用のために保存することができます。 </li><li>水20μl、水の3 mg / mlのα1-酸性糖タンパク質とマイクロチューブで透析コラーゲンモノマーの20μl20μlのを兼ね備えています。解決策は、無色透明であるべきである。 </li><li> 30分間室温で反応混合物を含むマイクロチューブを残す。この時点で、溶液は濁っなり、主にFLSコラーゲン線維を含むべきである。 </li></ol> 3。分節ロング間隔コラーゲン<ol><li>水の67μlの液、pH 3.3の100mMグリシン-HCl緩衝液60μlと微量遠心チューブとミックスの水に10 mg / mlのATPの40μlを兼ね備えています。 </li><li>マイクロチューブとのミックスにコラーゲンモノマー（0.01 N HClにて〜3 mg / ml）を33μlを添加する。解決策は、無色透明であるべきである。 </li><li> 2時間室温で反応混合物を含むマイクロチューブを残す。この時点で、解決策はまだ明確に見えますが、するべきでしょうほとんどSLSコラーゲンが含まれています。 </li></ol> 4。 AFMのキャラクタリゼーション<ol><li>薙ぎ払い粘着テープの切れ端で雲母の表面を覆うことにより、それを剥がすAFMの基板に取り付けられた雲母片の表面。マイカの全体の層が表面に凹凸を減らし、マイカが再利用されている場合、古いサンプルが削除されていることを確実にするために、切断されたことを確認し、その後テープを確認してください。 </li><li>新たに切断されたマイカ基板にコラーゲン線維の溶液20μlを適用します。 5分間のままにしておきます。 </li><li>優しく水でコラーゲン線維の溶液を洗い流してください。それは、マイカ基板の中央になくエッジで水を直接適用することは、それがサンプル全体に流れるようにしないことをお勧めします。 </li><li>窒素ガス気流下で表面を乾かします。それは、マイカ基板の中央にエッジとしないでストリームを向けることをお勧めします。 </li><li> 200倍の倍率で光学顕微鏡下では、ネイティブとFLSコラーゲンサンプルは線維の塊を示すべきである。 SLSのコラーゲンは表示されません。 </li><li>三つの異なるコラーゲン構造のユニークな特性は、AFMによって観察されています。窒化ケイ素AFMプローブを用いた接触モードのAFMと我々は通常、画像FLSおよびSLSのコラーゲン線維のに対し、シリコンAFMプローブを用いた間欠的な接触モードのAFMと一般的に、我々は、画像天然コラーゲン線維を、。我々は時間とコストの考慮のために、これを行う。シリコンAFMプローブは通常、イメージング天然コラーゲン線維の狭いバンド構造に特に有用に窒化シリコンAFMプローブ、よりシャープである。しかし、シリコンAFMプローブは、窒化シリコンAFMプローブよりコラーゲン試料による汚染をはるかになりやすいですし、頻繁に交換する必要があります。したがって、我々は主に解像度が大きい必要性であるイメージング天然コラーゲン線維のためのシリコンAFMプローブの使用を予約し、私たちはprolに間欠接触モードで動作有用性のオングは一生。 </li></ol>我々は、少なくともいくつかのコラーゲンの構成要素を示すべきである最初の100×100μm2のスキャンをお勧めします。そこから、10サイズ×10μm2とし、2×2のネイティブとFLSのコラーゲンのバンディング周期性を観察するためμm2であり 、またはSLSコラーゲンの細かい特徴をスキャンするにはズームイン。また、初期スキャンが代表的なものであることを確認するためにコラーゲンのサンプルには、少なくとも2つの他の領域を確認することをお勧めします。

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特別な利害関係は宣言されません。

コラーゲン単量体を精製し、低pHおよび温度で安定しており、天然コラーゲン線維の形成は、基本的にコラーゲンモノマー溶液のpHと温度を上昇させることを含む。モノマーから縞状コラーゲン線維の再構成の手順については、50年以上存在していた。私たちの研究室では、7〜15年前にコラーゲンと私たちの最初の研究で使用されている手順は、1986年10にチャップマンとその共同研究者によってまとめられた手順に基づいていた。 34でその以前の仕事のコラーゲン線維形成のための条件のNa 2 HPO 4 / KH 2 PO 4（I = 0.2、pH7.4）中コラーゲンモノマーの0.18 mg / mlであったバッファ℃、我々が試みていることをこのおよびその他の手順の欠点は、所望のバンドと一緒にフィブリル形成unbandedフィブリルが常にあるということです。私たちの新しい条件は〜100mMリン酸のコラーゲンモノマーの0.3 mg / mlおよび37で放置し、pH7での100mMのKClで3〜4時間インキュベートする。 procedureは天然コラーゲン線維を作るために、以前の手順から、あらゆる面で異なって、本明細書に記載。しかし、最も著しく、我々は、緩衝液の濃度を高め、100mMのKClを加えることによってイオン強度を倍増しました。もっぱら団結コラーゲン線維のより一貫した形成にイオン強度結果の増加。 コラーゲンモノマー溶液は使用の製造元の推奨期限を過ぎていたときに私たちの経験では、この手順では、ネイティブ型コラーゲンを生産していないことだけで時間があった。これが発生すると、何がすべてまだ観察多くのフィブリルにunbandedしかし主unbandedアール少ないフィブリルから範囲を観察される。期限切れのコラーゲンモノマーはしばしばまだ正常に天然コラーゲンを作るために使用することができますが、それが失敗したときに、新しいコラーゲンモノマーは間違いなく購入することがあることに注意してください。 FLSは最初Highberger らによって同定された。Orekhovicに入金コラーゲン製剤中の17はH ら18。さらなる研究がHighbergerとシュミットは、それが、FLS 12の形成を促進するα1-酸性糖タンパク質であったと結論づけている。我々は、後で市販のコラーゲンモノマーおよび低pHでα1-酸性糖タンパク質を合成して、ゆっくりとpHは24時間11水に対して混合物を透析することによって上昇させることによって、FLSのコラーゲンを作るための手順を再現することができました。我々は今、最初の水に対するコラーゲンモノマーを透析し、単にFLSコラーゲンを形成するために水でα1-酸性糖タンパク質と組み合わせることで、その手順の変更を提示します。ここで説明するFLSコラーゲンアセンブリのための条件ははるかに少ない時間がかかります。コラーゲンモノマーは、まだ水に対して透析したプリである必要があるが、それは一括で行われ、その後℃で安定して、それが使用されるまで4℃で保存することができます。この新しい手順利回りは主に縞状のコラーゲン線維をFLS。 我々の経験から、α1-酸性糖低い結合タンパク質と水分含量、および推論によって、より高い糖度を持つタンパク質が、正常にFLS線維を作るために重要です。我々は通常、我々が使用するα1-酸性糖タンパク質がたくさん組み合わさ％のタンパク質および水82以下のコンテンツを持っていることを製造元に確認してください。と天然コラーゲン合成のための手順と同様に、古すぎるコラーゲンモノマーはまたFLSコラーゲンを生成するために失敗することがあります。また、透析のために使用される水の純度がこの手順で重要である。さえ〜8MΩ.cmはなく、FLSコラーゲンを形成しませんコラーゲン溶液中で&gt; 18MΩ.cm水結果に対するコラーゲンモノマーの例については、透析。 3コラーゲン線維の種類、作成する最も簡単なのSLSのコラーゲンである。 SLSの早い準備がシュミットと同僚15によって記述されていた。我々は市販のコルを使用してSLSのコラーゲンを作るために12年前にその手続きの適応を発表アジャン14。手順は単純に2 mg / mlのATPおよび0.05％コラーゲンモノマーの0.5 mg / mlの（v / v）のpHは3.5で酢酸を組み合わせる伴、室温で一晩混合物を残す。 我々の経験では、制御しなければならない、SLSアセンブリの重要な側面は、反応溶液のpHである。 SLSは、微結晶の凝集した塊になって、より基本的な条件（pH約3.6から3.9）の結果に集まった。より酸性条件（pH約2.9から3.2）はpH 3.3から3.5の理想的な条件の下で組み立てるものより薄く、より分離した微結晶が得られる。この範囲外の反応pHは（&lt;2.8&gt; 4）任意のSLSコラーゲンを生むとは限らない。我々は過去に、酢酸を加えて反応混合物のpHを調整した。さらに手続きを簡素化するために、この原稿に、我々はpHを制御するためにグリシン-HCl緩衝液を導入しました。 文字を持っている上記のプロトコルから形成された三つの異なるコラーゲン構造唯一のナノメートルの分解能が可能な楽器で見分けることができるISTIC機能。ネイティブおよびFLSコラーゲンは〜67 nmと〜270nmの周期性をバンディングによって特徴付けられる。 SLSのコラーゲンの最長寸法はちょうど〜360 nmである。我々は、我々は、3つの異なるコラーゲン構造を特徴づけるためにAFMを使用する方法を具体的に説​​明しています。しかし、&lt;10nmの半径を有する任意のAFMプローブと接触または間欠的な接触モードで任意のAFMの動作はまた、画像これらのコラーゲン構造をできるようにすべきです。また、電子顕微鏡では、することができ、19これらのコラーゲン構造を特徴付けるために使用されています。 これらの手続きの主な利点は、それらが所望のコラーゲン構築主に生成することである。これらの反応に見られるコラーゲンの唯一の他の形態は、多くの場合、AFM像の背景に表示されている原料モノマーである。ネイティブとFLSのコラーゲンの場合、それらは容易にunreaのほとんどから分離することができるその結果、ネイティブまたは水とFLSコラーゲンペレットの繰り返し遠心分離と洗浄によりCTEDモノマー。 我々は、先進的、商業的に入手可能な出発物質を使用して、ネイティブは、FLSおよびSLSのコラーゲンを作るための、シンプルで信頼性の高い手順を提示している。これらのすべての手順で使用されるコラーゲンモノマーは、精製された形で市販されている。 α1-酸性糖タンパク質とATPは、商業的にも利用できる両方である。

コラーゲンは3本のポリペプチド鎖から形成された三重らせん構造を持っている構造タンパク質のクラスです。これらの三重らせんモノマーは、さらに徐々に大きく構造を形成する階層的な方法で組み立てる。 1が同定されている少なくとも28遺伝的に異なるコラーゲンの種類があります。組み合わせることで、コラーゲンはすべてコラーゲンタンパク質2の90％までのI優勢な形態の会計を入力して、動物に見られる全タンパク質の30％を占めています。 I型コラーゲンは、皮膚、靭帯、腱や骨にfibrillous構造として発見された。原子間力顕微鏡（AFM）と電子顕微鏡（EM）私天然コラーゲン繊維は通常約67 nmの3-5（多くの場合、D-バンドとも呼ばれる）の固有周期とバンディング見せるタイプのイメージ。 Iコラーゲンモノマーを入力すると、2つの同一のα1（I）鎖と比べてそれぞれ複数のα2（I）鎖から成る三重らせんヘテロです長い千個のアミノ酸である。それは、長さが300nm、直径1.4 nmの寸法を持つ細長いです。 Iコラーゲンモノマーを入力すると、自然に形成された高次構造6を破壊することによって容易に得ることができる。我々 7や他の多くの8-10は、これらの水溶性モノマーのビルディングブロックは、その後試験管 （ 図1） で 、D-バンドフィブリルを再構築するために使用されることが示されている。 天然コラーゲン線維のほかに、他の2つの高次コラーゲン構造が同一の単量体のビルディングブロックを用いてin vitro で形成することが見出されている。二つの構造は、繊維の長い間隔（FLS）と分節長い間隔（SLS）コラーゲン（ 図1）です。 FLSのコラーゲンは天然コラーゲンのようなfibrillous構造ですが、天然コラーゲン11よりも大きいバンディング周期性によって特徴づけられる。コラーゲンモノマーは、α1-酸性糖タンパク質と組み合わされたときin vitroでは 、FLSのコラーゲン形成<suP&gt; 12。 FLSコラーゲンはめったに13が、同様にin vivoで観察されている。モノマーは結晶格子14のようにレジスタに並んでいるので、SLSのコラーゲンが結晶として記載されている。コラーゲンモノマーは、アデノシン三リン酸（ATP）は15と組み合わせたときのSLSコラーゲンを形成します。天然由来のSLSのコラーゲンは線維芽細胞の培養液中で観察されなく抽出された組織サンプル中の、おそらくその小さなサイズと区別可能な地形の特徴16の不足のためにされています。 本稿の目的は、最も経験の浅い研究者が再現できるだけでなく、FLSおよびSLSコラーゲンと天然コラーゲン線維を作るための詳細な手順を提示することである。市販の高度な原料を使用して、我々はできるだけ単純なプロトコルを作ってみました、まだ彼らは確実に動作しています。我々の異なるコラーゲン構造を特徴づけるためにAFMを使用する方法についても詳細作られていますの。この作品は、これらの高次コラーゲン構造の1以上を研究、および/または他のアプリケーションでの前駆体として、それらを使用していますが、現在は専門知識の不足、または単に組織サンプルでは動作しないようにしたい研究者に有益なものとなろう。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材質/試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> Iコラーゲンモノマーを入力 （0.01 N HClにて〜3 mg / ml）を</td><td> Inamed アドバンストニッピ</td><td> 5409 5005-B </td><td>ロット1261443（2.9 mg / mlと、pHは2.1） ロット1629346（3.2 mg / mlと、pHは2.1） ロット6006（3.2 mg / mlで、pHは2.1） </td></tr><tr><td> ATP </td><td>国際研究生化学</td><td> -141 </td><td>ロットFBJ-1194A </td></tr><tr><td>ウシ血漿から、α1-酸性糖タンパク質</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G3643 </td><td>ロット051K7440（89.8％） ロット011K7410（82％） ロット065K7405（71.2％） ロット063K7495（71.9％） ロット117K7535（75.9％） （タンパク質+水分含量） </td></tr><tr><td> A1-酸glycoprヒト血漿からotein </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G9885 </td><td>ロット128H7606（70.9％） ロット049K7565V（68％） （タンパク質+水分含量） </td></tr><tr><td>マイカ</td><td>テッドペラ</td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - シリコンSPM-センサ​​ー</td><td>ナノワールド</td><td> NHC </td><td>我々は断続接触モードで使用するシリコンAFMプローブ</td></tr><tr><td> Veeco社のナノプローブのヒント</td><td> Veeco社 （現在はブルカーAFMプローブ） </td><td> NP-S </td><td>我々は接触モードで使用する窒化ケイ素AFMプローブ</td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

コラーゲン線維は、構造の足場と機械的強度を提供するために、動物組織の細胞外マトリックスに存在しています。これらの天然コラーゲン線維は〜67 nmの特性バンディング周期性を持っており、長さ、直径1.4 nmの300 nmであるI型コラーゲンモノマーの階層的なアセンブリを介して生体内で形成されており、in vitroでは 、どちらに条件を変化させることによって、単量体のビルディングブロックが露出して、50ミクロンの長さスケールにまで及ぶユニークな構造は、ネイティブ型線維だけでなく、繊維の長い間隔と分節長い間隔コラーゲンだけでなく、を含めて、構成することができる。ここで、我々は共通の市販のコラーゲンの単量体から3つの異なるコラーゲン構造を形成するための手順を紹介します。我々と他の人がこれらの3つのタイプは、通常の構造の混合物につながるように、過去に発行したプロトコルを使用して。特に、unbandedフィブリルは一般的にFだった天然コラーゲンを作るときoundここ、繊維状の長い間隔のコラーゲンを作るときに、ネイティブフィブリルはしばしば存在していた。これらの新しい手順は、ほぼ独占的に希望するコラーゲン線維の種類を生産できるという利点があります。所望の構造の形成は、原子間力顕微鏡を用いたイメージングによって検証されます。

天然コラーゲン 100mMリンで〜0.3 mg / mlのコラーゲン単量体と37のままにしてpH7の100mMのKClの反応混合℃で3〜4時間クリア〜67 nmのは、D-バンドとネイティブ型コラーゲン線維を含む溶液が得られる、 unbanded線維なし。 200倍の倍率で光学顕微鏡の下で、いくつかの線維の塊は、通常、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡（ 図2）で閲覧する場合は特にマイカ基板上で見ることができます。典型的なサンプルでは、AFMによるランダム100×100μmの2スキャンは通常、長い5-50ミクロン（ 図3a-c）は、少なくともいくつかの線維が表示されます。個々の、分離したコラーゲン線維が簡単にこの段階で特定することができます。 512×512画素2画像スキャンすると、10×10μm2でスキャンサイズにズームすると、すべてのフィブリルが団結していることを示している（ 図3D-F </stroNG&gt;）。正確にバンディング周期性を測定するためには、2×2μm2のスキャンサイズ（ 図3G-i）に拡大することが最善です。 周期性をバンディングは単にいくつかのピークや谷の間の長手方向の距離を測定し、平均化することによって決定することができる。 AFMのソフトウェアが許可されている場合あるいは、1次元フーリエ変換は、長手方向の断面に沿って変換を使用することもできます。 図4はフィブリルとそれに対応する縦断面のAFM高さ画像を示しています。 FLSコラーゲン 1 mg / mlのμ1-酸性糖タンパク質、30分間室温で放置し、水に約1 mg / mlのコラーゲンモノマーの反応混合物は、FLSコラーゲン線維の解を得ることができます。 天然コラーゲンの場合に観察されるものに類似したフィブリルの凝集塊は、簡単に200×mでの光学顕微鏡下でマイカ基板上で見ることができagnification。典型的なサンプルでは、AFMによるランダム100×100μmの2スキャンは、通常、少なくともいくつかの線維が表示されます。 512×512ピクセルの2つの画像のスキャンサイズで、バンディング周期性を示し、10×、より正確には10μm2スキャン（ 図5a）または2×2μm2のスキャン（ 図5b）。図5cにズームすることによって測定することができるFLSフィブリルの長手方向断面図。 SLSのコラーゲン 2 mg / mlのATPの反応混合物、2時間室温で放置のpH 3.3の100mMグリシン-HCl緩衝液中のコラーゲンモノマーの〜0.5 mg / mlのはSLSのコラーゲン溶液を得ることができます。 典型的には、SLSの結晶は、光学顕微鏡下では表示されません。 AFMは、SLSの結晶の存在を確認するために必要です。典型的なサンプルでは、AFMによるランダム100×100μmの2スキャンは、通常、多くが表示されますドット。 10×10μm2でのスキャンに拡大すると、通常、いくつかのSLS結晶（ 図6a）が表示されます。 2×2μm2のスキャン（ 図6b）は SLSの結晶の微細構造を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> 図1コラーゲンモノマーから in vitro で形成することができるコラーゲン線維の3つの構造的に異なる形。 AFM画像はすべて同じ大きさのスケール（2×2μm2）を上にコラーゲン単量体と3高次コラーゲン構造を描いた。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> 図2デジタルマイカ上に天然コラーゲン線維の光学DIC顕微鏡による〜200×倍率（）手つかずの画像と（b）閾値に、尖ったトンフィブリルを強調O。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> マイカ上の天然コラーゲン線維の図3 AFM像。断続的な接触モードAFM振幅画像が表示されます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> 図4（a）は0.5×1μmの2間欠接触モードAFM高さ画像（縦軸は= 100 nm）と天然コラーゲン線維の（b）は縦断面図。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> 図5マイカ上にFLSコラーゲン線維のAFM像。 （a）は10×10μm2と接触モードAFM偏向画像、（b）は、2×2μm2と接触モードAFM偏向イメージと（c）の縦FLSのコラーゲン線維の断面。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> 図6マイカ上のSLSコラーゲンのAFM像。断続的な接触モードAFM振幅画像が表示されます。

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

シンプルかつ再現手順は一般的な市販のI型コラーゲンの単量体から3つの構造的に異なるコラーゲン組立部品を形成するために説明されます。ネイティブ型は、繊維状の長い間隔または分節長い間隔のコラーゲンは、300nm長いと1.4 nmの直径の単量体のビルディングブロックがさらされる条件を変えることにより構築することができる。

ネイティブ、繊維状の長い間隔と分節ロング間隔コラーゲンのin vitro合成

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K ビュー.  University of Toronto. シンプルかつ再現手順は一般的な市販のI型コラーゲンの単量体から3つの構造的に異なるコラーゲン組立部品を形成するために説明されます。ネイティブ型は、繊維状の長い間隔または分節長い間隔のコラーゲンは、300nm長いと1.4 nmの直径の単量体のビルディングブロックがさらされる条件を変えることにより構築することができる。

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

ポリカプロラクトン、エラスチン、コラーゲンを使用してネイティブ動脈アーキテクチャを模倣するためにトライレイヤーエレクトロスピニング：予備的研究

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

生物工学

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

その場圧縮負荷と骨歯根膜歯繊維状合同の相関的非侵襲的イメージングで

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

携帯収縮機能を評価するために、マイクロスケールのシリコンカンチレバーの活用<em&gt;体外</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

ゼブラフィッシュ幼虫の改良実験操作のための長期のライブ イメージング デバイス

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...