この作品は、XACとAFPに国立科学カナダ工学研究評議会からの補助金によって支えられて

1。抽出のための材料の調製<ol><li>細胞の調製<ol><li>実験する前に、少なくとも1日に酸処理されたカバースリップ上種子組織培養細胞。我々は、これらの2つの細胞株が分泌されたタンパク質の強固な生産を示す限り、COS-7またはU2OSを使用し、よく定義されたERを持っています。高い抽出効率を達成するために、細胞は実験の日にカバースリップ上で80％コンフルエントを超えてはならないことに注意してください。 </li><li>特に外因性のmRNAが検討されている場合には、細胞は、標準的なトランスフェクションプロトコールを用いて目的の遺伝子を含むプラスミドで播種後1日目にトランスフェクトする。次に、細胞を抽出する前に少なくとも18時間のためのmRNAを発現するように許可されています。 </li></ol></li><li>翻訳阻害剤で細胞を処理<ol><li> ERでのmRNAの関連のメンテナンスにそのままリボソームの効果をテストするために、細胞の関連を混乱させる翻訳阻害剤で治療することができますmRNAは11とリボソームの。 </li><li> （4 -メチル-2,6 - dinitroanilino） - -などhomoharringtonin（HHT）、pactamycin、または2と翻訳開始の阻害剤、同時にに従事してリボソームを可能にしながら、N-メチルプロピオンアミド（MDMP）は、トランスクリプトとの関連付けから新しいリボソームを防ぐ12月14日翻訳を完了します 。哺乳動物細胞における最もタンパク質の翻訳速度に関係なく、コドン使用頻度またはmRNAの長さ15の、1秒あたり5個のアミノ酸であるため、30分の治療は27,000ヌクレオチド（タンパク質をコードする限り、オープンリーディングフレームを持つメッセージのリボソームをオフにクリアする必要があります）9000アミノ酸である限り。 </li><li>そのような阻害剤は、ピューロマイシンとして新生鎖の早期の排出を促進し、こうしてポリソーム12を破壊する 。しかし完全にmRNAとピューロ処理リボソームの関連付けを破壊するために、EDTAなどのキレート剤はマグネシウムジギトニン抽出バッファ11に追加する必要があります。 </li> &lt;liは&gt;この実験では、細胞を200μMのピューロマイシン、5μMのHHT、または抽出前に30分間コントロール培地で処理される。 </li></ol></li><li>ジギトニンのExtraction Bufferの調製。フリー（ すなわち細胞質、非ER関連）の転写産物の障害なく、ERに局在するmRNAを可視化するために、我々は選択的にジギトニン、3β-hydroxysterolsと優先的に相互作用するステロイド配糖体を持つ細胞を透過性。低濃度では、ジギトニンは選択&#39;漏出16&#39;を引き起こし、細胞膜の部分をpermeabilizes。これとは対照的に、コレステロールの貧しい小胞体膜と核膜は、16,17そのまま残されます。 <ol><li>ジギトニン（シグマアルドリッチ）粉末を5％重量/体積の蒸留水に溶解し、この原液を、小さなボリュームに分注し、-20℃で保存されている我々の経験では、融解後の再凍結は、溶解ジギトニンの効率を低下させる。 </li><li>の原液10倍のCHOバッファー（1Xワーキング溶液濃度：115ミリメートルのKAc、25mMのHEPES緩衝液pH7.4、2.5mMのMgCl 2、2mMのEGTA、150 mMスクロース）はRNaseフリーの試薬 ​​を用いて調製し、-20℃で保存されている作業溶液（1倍CHOバッファ）RNaseフリー水で原液を希釈することにより調製される、4℃で保存することができます</li></ol></li></ol> 2。ジギトニン抽出<ol><li>抽出溶液を準備する<ol><li>平坦な表面を有する加熱ブロックは、予備加熱40℃ですと抽出中にこの温度で​​維持した。 </li><li> RNaseフリーである平らな作業面を形成するためには、加熱ブロックは、パラフィルムM（ビーミスCompany、Inc）を新鮮な部分でいくつかの水と重なって湿らせる。パラフィルムシートおよび加熱ブロックの間に気泡がRNaseフリーの手袋やキムワイプ（VWR）を用いて平滑化される。 </li><li> 1X CHOバッファを水浴中でインキュベートすることにより、37℃に加温する。 </li><li> 6ウェルプレートを洗浄するために使用されそして細胞を固定。 3ウェルの各行は、1つのカバースリップのために使用されます。行の最初の2ウェルに、温められたCHO緩衝液2 mlを加えています。最後のウェルに、固定液（PBS + 4％パラホルムアルデヒド（電子顕微鏡学））2mlを追加されます。細胞は、抽出のための準備が整うまで、このトレイは、37℃のインキュベータに格納することができます。 </li><li>ジギトニン抽出液を使用直前に暖かいCHOバッファーで0.025％の株式ジギトニン溶液を希釈することにより調製される。もう一度ピューロ処理した細胞では、抽出用緩衝液は、さらに効率的にリボソーム11を破壊するために20mMのEDTAを含まなければならないことに注意してください。抽出溶液100μlの滴は抽出直前にパラフィルムで覆われた加熱ブロックに配置されます。 </li></ol></li><li>ジギトニン抽出と細胞固定<ol><li> 37℃インキュベーターからセルを削除します。 </li><li>抽出プロセスの実行中に、カバースリップをjewlerの鉗子の助けを借りて操作されます。ととも​​に鉗子は、カバーグラスをピックアップし、増殖培地の洗浄するだけでなく含有する第二の最初とCHOバッファにそれを浸し。 </li><li>迅速キムワイプでカバースリップの裏側オフ過剰バッファリングをオフにしみ、直ちに抽出溶液に、下向きにカバースリップ、セル側に配置します。 </li><li> 10秒後、ピンセットでカバーガラスを拾うとすぐに電池側はよく入った、4％パラホルムアルデヒド固定バッファに、上向きにし、それを転送します。 </li><li>室温で少なくとも15分間固定でサンプルインキュベートしてみましょう。 </li></ol></li><li>未抽出コントロール細胞の調製。細胞質内のmRNAの総量を決定するために、それが未抽出コントロールサンプルを準備することをお勧めします。 <ol><li>カバースリップ上で培養した細胞はジギトニン抽出工程（2.2.3）がスキップされることを除いて、（セクション2.2を見てください）​​上記のように調製されています。 </li><li>固定後、非抽出された細胞をPBS +0.1％Tritonで透過処理する必要がX-100で室温で15分間インキュベートした。 </li></ol></li></ol> 3。 FISH染色<ol><li> 蛍光 in situハイブリダイゼーションのためのプローブを設計<ol><li>利害のmRNAの一次配列は、RNAstructure 5.0 18などのRNA二次構造予測ソフトウェアを使用して折り返されている。 mRNAの折り畳みが視覚的に主要な二次構造の自由である約50ヌクレオチドの領域を識別するために評価される。 </li><li>この領域の逆相補は、プローブの5 &#39;末端（統合DNA Technologiesから購入）に取り付けられたAlexa546蛍光体で合成される。 </li><li>プローブは-20℃で保存することができ、100μMのストック濃度にRNaseフリー水で希釈して</li></ol></li><li> FISHプローブによる染色<ol><li>ただしジギトニン抽出した細胞が0.1％2mlのトリトンX-100で希釈し、これらの固定サンプルを処理、さらに透過処理を必要としないことに注意してくださいPBSは、FISH染色の前に室温で15分間、バックグラウンド信号を低減するのに役立ちます。 </li><li>次いで、スライドを任意の残留ホルムアルデヒドまたはTriton X-100を削除するには、PBSで2回洗浄する。 </li><li>次に、細胞を1Xクエン酸ナトリウム緩衝液（150mM NaClおよび15mMクエン酸ナトリウム）で25％〜60％ホルムアミドで2回洗浄する。一般的には、長さが50から60ヌクレオチドである特定のFISHプローブ、60％ホルムアミドが使用されますが、オリゴ（dT）FISHプローブを用いた染色ポリ（A）mRNAについて、ホルムアミドのレベルは25％にまで低減されています。 </li><li>染色槽を準備するには、150ミリメートルペトリ皿の底は水でおおわれているとパラフィルム片を水に浮かべています。水はこのようにパラフィルムが皿の底に付着することができ、皿を裏返すことによって除去される。気泡が手動でキムワイプで除去される。 </li><li>各カバースリップが染色されるためには、額面上に関心のFISHプローブを含むハイブリダイゼーション溶液100μlドロップをピペット染色チャンバー内afilm。在庫FISHプローブはの作業濃度にハイブリダイゼーション緩衝液で25％〜60％ホルムアミド（1×SSCは、100 mg / mlの硫酸デキストラン、1 mg / mlの酵母tRNA、5mMのバナジルリボシド複雑な、25から60パーセントホルムアミド）で希釈し、 0.2μMで。ホルムアミドの量が使用されている特定のプローブに最適化されており（ステップ3.3.3を参照）SSCの洗浄緩衝液と同じ濃度で存在すべきであることに注意してください。 </li><li>カバースリップは、このような組織培養インキュベーターとして加湿チャンバーに37℃で染色室で魚の溶液上にセル側に前面を下にして置き、5から24時間インキュベートする。 </li></ol></li><li>染色サンプルを洗浄し、取付<ol><li> RNaseフリーウォッシングエリアを準備するには、そのような実験台として、レベル、平らな面にパラフィルムのストリップを敷設。レベルの表面ぬれた、パラフィルムが平らであることを確認するには、上にパラフィルムを配置して、手動でキムワイプで任意の気泡を除去する。 </li><li>染色室ですインキュベーターから取り出し、平らな平らな場所に置いた。カバーガラスは、その後、それぞれのカバースリップの端の近くに魚の洗浄緩衝液約500μlのピペッティングして浮いています。溶液は毛細管作用を介して、カバーガラスとの間にパラフィルムで、描画されます。 </li><li>各カバースリップでは、洗浄緩衝液1ml（1×SCCの25から60パーセントのホルムアミドで、3.3.3のステップを参照してください）​​は、洗い場のパラフィルム（ステップ3.4.1を参照）にピペッティングしています。 </li><li>ピンセットを用いて、カバーガラスを染色室から除去され、それぞれを洗浄緩衝液滴の上に置かれており、室温で5分間インキュベートした。洗浄工程を3回繰り返す。 </li><li>スライドガラスを70％エタノールで洗浄し、キムワイプで乾燥させる。 </li><li>各カバースリップについては、マウントソリューション（DAPI Fluoromount™をG、南部Biotech）の25μlをスライドに分注される。このソリューションは、4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）、汚れのDNAが含まれており、核の可視化を可能にすることに注意してください。 </li><li> USIngの鉗子とキムワイプ、カバースリップの背中を乾燥させ、余分な魚の洗浄緩衝液は、試料を乾燥させずにオフにブロットする。各カバースリップはその後マウンティング溶液の液滴の上に、下に向けてセル側に配置されている。 </li><li>マウントされたサンプルは、標識されており、4℃で保存することができます</li></ol></li></ol> 4。イメージングと定量<ol><li>イメージング<ol><li>落射蛍光顕微鏡をFISH染色後の画像にセルを使用されています。トランスフェクトされた細胞は、適切なチャネルで明るい蛍光シグナルによってトランスフェクト細胞から分化することができます。理想的には、取得した各フィールドには、定量化のためのバックグラウンド蛍光を決定するために使用するトランスフェクトしていないセルが含まれています。 </li><li>各フィールドの魚およびDAPIチャンネルの画像が得られる。また、細胞はタンパク質マーカーと共染色されている場合は、免疫蛍光チャンネルの画像も取得されています。ジギトニン抽出を使用することもできることに注意してください小胞体に結合したリボソームとタンパク質11を可視化する。 </li><li>フィールド間の蛍光強度を比較することができるようにするには、各チャネルの露光時間は、実験の各セットに一定のままで残っているはずです。 </li><li>再び別のカバースリップ上の細胞との間の蛍光強度を比較することができることを保証するために、魚の信号でepiluminescence強度や崩壊での日々の変化は、イメージング、単一一気にカバースリップのすべてをすることによって最小化されるべきである。 </li></ol></li><li>定量。小胞体に局在するmRNAの量を定量化するために、我々は、 ニコンのNIS要素ソフトウェアを使用しています。しかし、このようなImageJのような他の画像解析ソフトを使用することができます。 <ol><li> ニコンのNIS要素画像解析ツールを使用して、細胞周囲と核が興味（ROIの）の別々の領域として概説されています。 </li><li>各ROI、蛍光強度（I T総細胞強度のためと私はNのために核の強度）と領域（TとN）を記録し、Excelスプレッドシートにエクスポートされます。 </li><li>各画像は、バックグラウンド蛍光強度（I B）は 、非トランスフェクトされた細胞の強度を記録することによって決定される。ポリ（A）mRNAレベルが分析されている場合は、セルの空き領域が選択されています。 </li><li>合計ERの量（抽出した細胞）または細胞質（未抽出細胞）の蛍光は式で計算されます。 [A、T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li>核の染色強度も計算し、様々なトリートメントの間の内部コントロールとして使用することができます。核はジギトニン処理17またはリボソーム混乱11には影響されませんので、核のmRNAの量は、これらの治療法のそれぞれの間に一定のままで残るべきです。核蛍光を計算するには、次の式が使用されます。 [A、N] [I N - IB] </li><li> ER-標的である細胞質mRNAの30から40％が未抽出細胞から細胞質の平均蛍光で割った30から40抽出した細胞の平均的なERの蛍光（4.2.4参照）を取ることによって計算することができます（再度4.2.4を参照） 。それが抽出され、未抽出細胞が調製染色し、並行して画像化されることが重要です。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+(SRP)+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li><li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+(SRP)+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein.">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. 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特別な利害関係は宣言されません。

様々な細胞内のサイトへのmRNAの局在化は、mRNA局在タンパク質と転写産物の相互作用を介して、細胞内のローカルな要件への彼らの最終目的地へのタンパク質が適切にソートするため、遺伝子発現の微調整のための重要な広範な現象である地域19,20。 ここに記載のアッセイを用いて、我々は、分泌タンパク質をコードするmRNAがリボソームや翻訳の存在下または非?...

真核生物では、コードするmRNAは、翻訳時の3,4リボソームとtransloconsの間の直接的な相互作用を介して分泌され、膜タンパク質は、共同翻訳シグナル認識粒子1,2によってERに標的とすることができるし、ERに保持することができる。しかし、mRNAはごく最近まで不明であったリボソームや翻訳のいずれかの独立した小胞体に標的にし、維持することができるかどうかを指定します。これまでの研究では、細胞分画技術を用いて、ERでの翻訳に依存しないmRNAの関連があるかどうかを対処しようとしました。過酷な化学的条件は潜在的に繊細なmRNAの小胞体関連が中断される可能性があり、ER由来の小胞から、リボソームの関連付けを解除する必要がありましたので、これらの研究では、5月8日のための証拠を提供する、決定的なものではなかったと9,10に対してリボソーム依存しないmRNAのERへのアンカリング。 これらの問題を回避するために、我々はprotoを開発しました小胞体に結合したmRNAを単離すると、画像にCOL。この手順では、同時に、ER形態とその関連分子のすべてを保持しながら、効果的に細胞（非小胞体に結合したmRNAを含む）のすべての細胞質のコンテンツを削除し、軽度抽出処理を伴う。このプロトコルを使用して私たちは、mRNAのサブセットを対象としており、その後、リボソームまたは翻訳を11の独立して、ERに保持されていることを実証した。

visualization of endoplasmic reticulum localized mrnas in mammalian cells

真核生物では、分泌され、膜タンパク質は小胞体（ER）の表面に局在しているエンコードのメッセンジャーRNA（mRNA）のほとんど。しかし、これらのmRNAの可視化が困難な場合があります。これは、mRNAの一部のみがER関連のときは特にそうであり、この細胞小器官への分布は非標的（ すなわち &quot;自由&quot;）転写産物は妨害されます。同時に、ERの整合性を保ちながら、ER関連mRNAを監視するために、我々は、細胞が選択的に細胞膜をpermeabilizesジギトニン抽出溶液に短い露光で処理させる方法を開発し、したがって細胞質内容が削除されました。このメソッドはin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inと結合されているとき、1は明らかに蛍光顕微鏡で、ERに結合したmRNAを可視化することができます。このプロトコルを使用してバルク·ポリ（A）転写産物または特定のmRNAのいずれかのためにER-関連度を評価することができるさらに定量化した。プロセスでは、1は、mRNA-ERの相互作用の性質を調べるために、このアッセイを使用することができます。

ER関連であるmRNAの割合を決定するために、 胎盤アルカリホスファターゼ（ALPP）またはシトクロムP450-8B1（CYP8B1）が含まれていたプラスミドでトランスフェクトしたCOS-7細胞のいずれかジギトニンで抽出した後、固定、または直接修正されました（ 図1を参照して、比較する&quot;Ctrlキーを抽出された&quot;には&quot;Ctrlキーを押しながら未抽出&quot;）。非核保有蛍...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

ここでは、哺乳類の組織培養細胞に小胞体関連mRNAを可視化する方法を説明します。この手法は、蛍光灯に続く細胞質の内容を削除するジギトニンと形質膜の選択的透過性上昇を伴う<em&gt;その場で</emどちらバルクポリ（A）mRNAまたは特定の転写産物を検出するために&gt;ハイブリダイゼーション。

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.2K ビュー.  University of Toronto. ここでは、哺乳類の組織培養細胞に小胞体関連mRNAを可視化する方法を説明します。この手法は、蛍光灯に続く細胞質の内容を削除するジギトニンと形質膜の選択的透過性上昇を伴うその場でハイブリダイゼーション。

ビデオ: Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

哺乳動物細胞をトリプシン処理し、継代培養

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

生物学

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

接着および非接着性の哺乳動物細胞の in situ細胞下分画で

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

マイクロインジェクションによる哺乳動物細胞におけるmRNA核外輸送の速度論の解析

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Isolation of mRNAs Associated with Yeast Mitochondria to Study Mechanisms of Localized Translation

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized near the mitochondria. Support for this possibility is derived from recent studies, in which many mRNAs encoding mitochondrial proteins were shown to be localized to the mitochondria vicinity. Together with earlier demonstrations of ribosomes&#8217; association with the outer membrane, these results suggest a localized translation process. Such localized translation may improve import efficiency, provide unique regulation sites and minimize cases of ectopic expression. Diverse methods have been used to characterize the factors and elements that mediate localized translation. Standard among these is subcellular fractionation by differential centrifugation. This protocol has the advantage of isolation of mRNAs, ribosomes and proteins in a single procedure. These can then be characterized by various molecular and biochemical methods. Furthermore, transcriptomics and proteomics methods can be applied to the resulting material, thereby allow genome-wide insights. The utilization of yeast as a model organism for such studies has the advantages of speed, costs and simplicity. Furthermore, the advanced genetic tools and available deletion strains facilitate verification of candidate factors.

Many mRNAs encoding mitochondrial proteins are associated with the mitochondria outer membrane. We describe a subcellular fractionation procedure aimed at isolation of yeast mitochondria with its associated mRNAs and ribosomes. This protocol can be applied to cells grown under diverse conditions&#160;in order to reveal mechanisms of mRNA localization and localized translation near the mitochondria.

ローカライズされた翻訳のメカニズムを研究するために酵母ミトコンドリアでのmRNA関連のアイソレーション

Most of mitochondrial proteins are encoded in the nucleus and need to be imported into the organelle. Import may occur while the protein is synthesized ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

哺乳動物細胞におけるヘム合成レベルの測定

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...