私たちは、この作業の過程を通して原稿とその議論のための私たちの研究室の他のメンバーの批判的な読みのためにメイ·アン·リムに感謝します。この作品は、山田科学財団と王立協会ショートビジットフェローシップとKKに対するEUのマリー·キュリー国際着信フェローシップGRR、とBBSRCプロジェクト無償（BB/H002278/1）とウェルカムトラスト機器グラント（073228/Z/03/Z）によって賄われていたAHに

1。ステージングされた幼虫のコレクション<ol><li> 25℃で3時間貼り酵母の小さなスコップを添加した寒天とグレープジュースでシャーレに卵を産むための円筒状の風防ケージに入れ、15女性と15成人男性のハエ℃、プレート3-4回曜日を変更し、第1プレート（O / N卵産卵からIE）を捨てる。また初日からプレートを捨てる。 2日目から、25℃の卵でプレートを保つ卵を集めてから7日後、親ハエのセットアップ新しい始まります。 </li><li>約24時間後、卵から幼虫が孵化。間伐絵筆でまたは鉗子のペアで幼虫をフックすることによって、ブドウ寒天から標準のフライ食品（10ミリリットル）（ 図1A）を含むバイアルに35幼虫を移す。 </li><li> 25℃で3日間幼虫（産卵後96時間、AEL）を含むバイアルを維持℃に</li></ol> 2。文化のための幼虫の腹側神経索の解剖<ol><li>ことを清掃70％エタノールでNCHと手。 70％エタノールで鉗子と針の4染色ブロック、2ペアを浸し、空気乾燥させます。 </li><li> （M3 PSエクジソン無料、1％ペニシリンおよびストレプトマイシンをシールドとサンヒョンM3の昆虫培地2mlをもう1つ、きれいにし、幼虫を掃除プールになるように蒸留水（DW）を使って1次メディアと4染色ブロックを準備腹側神経索（VNCs）を解剖したプールにM3のPS培地2mlでサード;;と刺すVNCsをM3へのPS培地2mlを持つ第四の幼虫を解剖するための媒体）。すべての試薬を室温に予め温めなければなりません。 </li><li> 96時間AELの幼虫を含むバイアルに水を追加します。その後、へらを使って、そっと濡れたペーパータオルに上のバイアルからの幼虫を餌を広げた。食べ物を洗い流してDWを含む染色ブロックに10幼虫を移してください。 DW 6回交換してください。次にM3のPS培地と交換してください。 </li><li> M3のPS培地2mlを含む染色ブロックに幼虫の1を移す。 </li><li>解剖顕微鏡下で、ジ標準的な方法12を使用して慎重に幼虫の脳をssectが、組織の損傷を最小限に抑えるため、以下の方法で進めることで、特別な注意を払う。幼虫の背側を上に置き、鉗子の2ペア（それぞれの手で1つ）で前方端から3分の1に背側を保持します。前方部を保持しながら、鉗子で後端を引き離して、表皮を引き裂く。脳とVNCは前半の後縁から見えるはずです。慎重に体脂肪、腸、表皮を除去することによって、脳やVNCの複合体を単離する。 VNCsがあまりにも多くの被害を受けている場合、VNCsは怪我を刺しなくても、完全にまたは部分的に退化します。考慮に入れ、以下の点を取る： </li></ol><ul><li>これはVNCを傷めますので、胸部のVNCから成虫および末梢神経を引っ張ったり、破れないようにしてください。末梢神経を切断するために、互いに近接して配置された鉗子2対の末梢神経を押しながら、ために神経を引っ張るCEPS。成虫と口の部分は、VNCに添付しておくことができます。 </li><li>脳に接続されているリング腺やリンパ腺のままにしておきます。 </li><li>過言ではない食品が含まれている、脳に最も近い時点で腸を切った。 </li></ul><ol start="6"><li>先端はカットオフと少し広がったとP20のピペットマンを使用することにより、新鮮なM3のPS培地を含む染色ブロックにVNCを転送します。 VNCを転送する前に、最初のヒントに付着VNCを防ぐために、解剖の目的のみに使用される培地をピペッティングします。 </li></ol> 3。 ショウジョウバエ幼虫VNCに傷害を刺すこのセクションでは、VNCsに刺すような傷害を実行すると、時間経過の解析と免疫染色のために刺さ-VNCsを準備する方法について説明します。ポスト刺す培養条件と期間は、第5条（タイムラプス解析用）および第6条（免疫染色用）で説明されています。 <ol><li>時間経過に十分なVNCs（4-5をプールした後、と）免疫染色のための24の上に、M3のPSを含むクリーンな染色ブロックに1 VNCを転送します。 </li><li>オリエントVNCはとても背神経網は、解剖顕微鏡（ 図1B）の下に表示されていること。これは、視神経のローブに接続したときに嘘をつくVNCsにとって最も自然な方向である。 </li><li>刺す手動で直角に事実上背側から、解剖顕微鏡下でタングステン針を使用し、VNCの腹部の半分（ 図1B）を目指す。 </li></ol>以下に特に注意してください： <ul><li>一度だけ刺す。 </li><li>針刺すまでは、グラスの底を打つ。しかし、針の先端を損傷しないように注意してください。 </li><li>持針器の茎が刺す時に媒体を触れてはならない。 </li><li>傷は解剖顕微鏡下で可視ではありません。 </li></ul>注：刺し傷無関係変性手順刺すような病変からVNC異なる内細胞変性をもたらすことができます。神経網の穴の変性の結果、たまに穴が非刺さ標本の皮質で観察されている。また、VNCの表面に影響を与える神経網または広範な変性に影響を及ぼす変性症検体は廃棄しなければならない。変性は、次のように識別することができます： <ul><li>刺殺の22時間で、特に胸部の横/腹側領域での粗面、、。極端なケースでは、VNCが突出して見えます。 </li><li>蛍光免疫染色によるバックグラウンド信号の穴のように見えることができます胸部神経網の穴または液胞。 </li></ul> 4。針や鉗子のメンテナンス<ul><li>日常的に針の先端が十分にシャープであるか​​どうかを確認します。針の先端は、いくつかの実験のためにそれを使用した後に曲がったり鈍することができます。このケースでは、アーカンソー州石または同等品を使用して先端をシャープに。 </li><li>鉗子の先端を行う必要があり完璧に満たしています。ヒントは、使用に損傷を受けることができます。このケースでは、アーカンソー州石または同等品を使用して先端を調整します。 </li></ul> 5。刺さVNCsの文化とタイムラプス録画 G9 13 - -リビングVNC、すべての軸索をラベル付けしGFPタンパク質トラップラインの軸索の神経網を可視化するために使用することができ、すべてのグリア細胞（正中グリア除く）を可視化するためにグリアドライバrepoGAL4はUASdsRedを表現するために使用することができますS197Y 14レポーター。交差点G9によってUASdsRedS197Yに飛ぶ;; repoGAL4ハエ、子孫の幼虫からVNCsは、生体組織に記録することができます緑の軸索とグリア赤で得られる。 <ol><li>プーリング4-5 VNCs後、VNCのきれいな染色M3 PSの2ミリリットルを含むブロック、そして、スタブへの転送1 VNC腹部の半分は、セクション3で示されている。 </li><li> M3の1ミリリットルを含むポリ-L-リジンコートさ3.5ミリメートルのガラスボトムシャーレに刺さVNCを転送PS。 VNCs背側を下にして置きます。優しくVNCは皿に固執できるように鉗子の平らな面を使ってVNCを押してください。 </li><li>穏やかに7.5％にFBSの最終濃度をレンダリングM3 PS 15％のFBSの1 mlを加える。 </li><li>レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いて画像を取得する。その全体の厚さ全体のZセクションシリーズを収集し、VNCをスキャンします。我々は、温度制御された環境チャンバーとライカSP2倒立共焦点顕微鏡を使用していました。これらに相当する共焦点顕微鏡は動作するはずです、しかし、それは検索の設定の最適化を必要とするかもしれません。当社タイムラプス共焦点顕微鏡の設定は以下の通りであった：環境室の温度：25℃、4倍ズームと20倍対物レンズ、スキャンモードxyzt、512×512ピクセルの解像度では、z = 1μmステップ、1時間または2 - 時間間隔。 </li></ol><ul><li>ライカSP2共焦点顕微鏡は、走査型のファイルサイズには限界がある。これらの設定で、8月9日の時点でスキャンすることができます。ととも​​に他の共焦点顕微鏡は、それはすなわち 、最大24時間までのスパンで、長い時間ポイントのために画像スタックを取得することが可能であるべきである。 </li></ul> 6。刺さおよび固定VNCsの文化や免疫染色<ol><li>ウェルあたりM3 PS 7.5パーセントFBSの500μlを含む24ウェル組織培養プレートを準備します。 </li><li> 24ウェル組織培養皿のための24以上のVNCsの解剖を繰り返します。 </li><li>先端カットオフとP20のピペットマンを使用することにより、ウェル当たり1 VNCを使用して、培養皿にプールから12非刺さVNCsを転送します。 </li><li>セクション3で説明したように、プール内VNCsの刺す残り。各ウェルにそれぞれ刺しVNCを転送します。 </li><li>実験に応じて所望の持続時間のために25℃のインキュベーター内で24ウェル皿を置きます。細胞の完全性は、少なくとも24時間、変更されません。 </li><li>培養後、先端のカットオフとP20のピペットマンを用いて1.5 mlチューブで4％ホルムアルデヒドPEMの250μlの12 VNCsを転送します。その後、fixatiVEは慎重VNCsを傷つけないように注意しながら、外にピペッティングします。サンプルをカバーするのに十分な固定剤の少量を各チューブに残るべきである。その後、新鮮な固定液を追加して、穏やかに室温で50分間攪拌する。 </li><li> 0.3パーセントのTriton X PBSで2回すすぎ、その後室温で0.3％トリトンX PBSで10分間2回洗浄する。 </li><li>室温で1時間、0.3％トリトンX PBS中の10％正常ヤギ血清と共にインキュベートすることによりブロックVNCs。サンプルは、少なくとも1ヶ月間、4℃で保存することができます。 </li><li> 4℃以上20時間一次抗体とともにVNCsをインキュベート℃に</li><li>室温で0.3％トリトンX PBSで10分間3回洗浄した後、0.3％トリトンX PBSで2回すすいでください。 </li><li> 4℃以上で16時間二次抗体とVNCsをインキュベート℃に</li><li> 0.3パーセントのTriton X PBSで2回すすぎ、次いで室温RT（暗闇の中で蛍光二次抗体を使用している場合）で0.3％のTriton X PBSで10分間3回洗浄します。 </li><li>少なくとも、50％PBS：50％グリセロールを含むPBSを交換してください時間。 </li><li>その後、80％グリセロールで置き換える：20％PBSを少なくとも1時間。 </li><li>顕微鏡のスライドガラス上のチェロテープの2層（約0.06ミリメートル）で行われたウィンドウにVNCをマウントします。向きを調整して、ウィンドウの上にカバーグラス（18×18 mm）を配置します。二つVNCsは、このメソッドを使用してスライドにマウントすることができます。 </li></ol>一次抗体のさまざまな方法を使って、怪我に異なる細胞応答（細胞数および細胞の形状変化など ）を分析することができる。 7。 ImageJとプラグインの範囲を使用してデータを分析 VNCは無関係変性を刺していない場合は、サンプルは病変の大きさにかかわらず、分析のためにカウントする必要があります。刺殺は手動で行うように、病変の大きさはその都度異なります。したがって、統計的には可能な限り、刺すことの効果を分析することが重要です。 <ol><li>サイズ測定を巻いた。傷の大きさは、修理15の指標である。刺すような病変は、GFPの発現を欠くとして表示されます。次のように病変領域は、自由に利用できるImageJのソフトウェアを使用して失効データを測定することができる： <ol><li> ImageJを使って、 &quot;ファイル&quot;メニューから、共焦点画像スタックを開き、 &quot;インポート&quot;を選択し、ここから &quot;画像シーケンス&quot;を選択します。これはスタックに個々のイメージのコレクションを向けるだろう。 </li><li>次に &quot;イメージ&quot;メニューに移動して &quot;Hyperstack&quot;に &quot;スタック&quot;を変更、 &quot;Hyperstack&quot;を選択し、 &quot;Hyperstackにスタック&quot;を選択します。 </li><li> &quot;イメージ&quot;メニューから &quot;プロパティ&quot;を使用してボクセルサイズを設定します。ライカSP2共焦点顕微鏡を用いて取得したデータでは、ボクセルサイズは、走査ソフトウェアから、画像と一緒に保存されたメタデータのテキストフ​​ァイルから取得することができます。第3節で説明したように我々の設定では、ピクセル寸法は、xy = 0.366211程度とz = 0.99709程度である。 </li><li> 1時点のすべてのスライスを調べることによって、ツール·バーに多角選択ツールで病変領域の最大輪郭を描画します。これは関心領域（ROI）。 </li><li>メニューの &quot;分析&quot;に行くことによって、ROIマネージャーにROIを追加し、 &quot;追加&quot;、スクロールダウンして、 &quot;ツール&quot;、次に &quot;ROIマネージャー&quot;を選択します。 </li><li>すべての時点にこれを繰り返します。 </li><li>各ROIの領域のサイズを取得するためのROIマネージャーに &quot;測定&quot;ボタンをクリックします。 </li></ol></li><li>タイムラプス録画時にVNCの動きの補正。 &quot;Stackreg&quot;と&quot;Turboreg&quot;プラグイン16（ImageJのウェブサイトから<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ）：これらのプラグインは、時間経過の間に少量のサンプルの動きを補正することができます。すべての時間のポイントを通って同等の代表光学部を使用してスタックを構築し、プラグインを適用します。それは、時間の経過とともにどのように変化する病変を可視化するのに役立ちます。これらのメソッドの詳細については、取扱説明書では、これらのプラグインを開発した研究グループから提供されています。 （ <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/" target="_blank">http://bigwww.epfl.c</a>H / thevenaz / stackreg /）。 </li><li>グリア細胞の自動カウント。 &quot;DeadEasyグリア&quot;プラグイン（ <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html</a> ）：これは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCのレポ陽性グリア細胞の数をカウントするとグリアの変化を調べるために開発されました数が17を刺した傷害によって引き起こされる。プラグインは、0.1パーセント、偽陽性、4.3％偽陰性17のエラーで、正確に動作します。このプラグインは、最初のラベルに抗REPO抗体で免疫蛍光を用いて検体中のすべてのグリア（正中線を除く）を使用します。その後、プラグインをインストールしImageJの中で、共焦点画像スタックを開き、プラグインが実行されます。これは、約30秒後に自動的にグリア細胞をカウントします。 </li><li>アポトーシス細胞の自動カウント。 &quot;DeadEasyカスパーゼの幼虫&quot;プラグイン（ <a href="http://www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html" target="_blank">www.bioscienc</a>es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html）18：これは、抗切断され、カスパーゼで標識された細胞の数をカウントするために開発され、新しいバージョンが幼虫VNCs用に脚色された。刺すような傷害は、プログラムされた細胞死11の増加を引き起こす。 、このプラグインは抗切断さカスパーゼ-3抗体で免疫蛍光を用いて試料の最初のラベルアポトーシス細胞を使用します。その後、プラグインをインストールしImageJの中で、共焦点画像スタックを開き、プラグインが実行されます。これは、約30秒後に自動的にアポトーシス細胞をカウントします。 </li></ol> 8。試薬<ol><li>培地：シールドとサンヒョンM3の昆虫培地、7.5％ウシ胎児血清、1％ペニシリン及び1％ストレプトマイシン。 </li><li>無菌DWの0.01パーセントポリ-L-リジン。 </li><li>固定：4％ホルムアルデヒド、PEMの超純（0.1Mパイプ、2mMのEGTA、1mMのMgSO 4）し、ソリューションを提供します。 </li><li>免疫染色用ブロッキング液：0.3％トリトンX PBS中の10％正常ヤギ血清。 </li><li>アンチグルタミンシンテ2抗体：ブロッキング溶液で1:250。 </li><li>抗GFP抗体：ブロッキング溶液で1:1000。 </li><li>抗REPO抗体：ブロッキング溶液で1:250。 </li><li>抗ELAV抗体：ブロッキング溶液で1:250。 </li><li>抗切断カスパーゼ3抗体：ブロッキング溶液で1:1000。 </li><li>二次抗体：ブロッキング溶液で1:250。 </li></ol>

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	<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr. Biol. 22, 590-595 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J. 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U.S.A. 107, 20553-20558 (2010).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちは、負傷、修復及び再生に対する細胞応答を調べるために、ショウジョウバエの幼虫の中枢神経系に損傷を刺すためのプロトコルを確立しています。幼虫VNCsを切開し、それらがタイムラプス顕微鏡で撮影またはグリアおよびニューロンアポトーシスまたは細胞分裂を可視化する蛍光免疫染色のために固定された後、刺されています。時間をかけて病変の進行を測定することができます。このメソッドは、負傷時や修理時の細胞数の変化を定量的·統計的分析のために意図的に開発されたソフトウェアが付属しています。 我々は前蛹と成虫その後フライに移行するために、96時間AEL幼虫（これらは、固定またはさらに発展させた）、発達段階を刺した。広告のそれと類似しており、神経系は、すでに完全に機能している、彼らは3齢段階の真ん中にあり、したがって、まだ蛹化を受けていません、96時間後に、VNCsは刺すために十分な大きさULT。それは少し後の幼虫で刺すことが可能かもしれないと正確なタイミングは、研究課題に合わせて選択する必要があります。しかし、対処の質問に応じて、それは一般的傷害に対する細胞応答を観察するために、しばらくの間、文化VNCsをする必要があろう。 120時間AELの蛹化後しばらくは、中枢神経系を改造している期間が開始され、このように避けた方が良い。したがって幼虫にプラス文化を刺すための時間枠はむしろ制限されています。幼虫を使うことはまだ成人を使用する上で、大きな技術的利点を持っています同様に成人に、一方で、神経系が損傷への応答を分析し、すでに幼虫のかなり簡単かつ迅速に、完全に機能されています。 皿の中で培養することなく、同等の後の時点で切開しVNCsに皿に解剖し、培養脳とVNCsの大きさと形態を比較すると、その開発は、in vivoでより文化の速度が遅くなって表示されます。他の点では、開発は、通常、培養液中で、組織の整合性が保持され、細胞が生きている複数の応答を示している上に運びます。傷の拡大、神経網の修理やグリア増殖は22時間後に刺す内で行われます。これは傷害に対する細胞応答が文化で行われ、その日よりも長い間外植体を維持する必要がない可能性が最も高いがあることを示している。長期的な文化が望まれている場合、プロトコルは培養プレートインサート5を使用するなど、さらなる最適化が必要な場合があります。 変性のものから良質のサンプルを特定することが重要である。このプロトコルを最適化することは、いくつかのスキルを取得して、必然的に変性がいくつかの標本で発生します。 VNCは、組織の完全性（ 図5B）の内訳を反映して&quot;カリフラワー&quot;外観を取得することができます。変性も無傷、非刺さ標本（ 図5Cに存在することができる刺すの独立してVNCの空胞化、によって認識されている</strオング&gt;）。これらのサンプルは捨てなければなりません。変性が最も可能性の高い神経やグリアの表面保護層を引き裂くことができる粗い解剖によって引き起こされる。したがって、細心の注意を穏やかに解剖するよう注意しなければならない。その他の影響要因は、プロトコルに示されているように洗浄し、タイミングに厳密に付着し、きれいと抗生物質と一緒に保管しなければならない培地を含む。最後に、針の針と針ホルダー、大きさやシャープネスの長さが非常に重要である。ニードルホルダーは、培養培地を汚染し、鈍針が自分自身を修復することができず、変性につながる大規模な人身事故を招くことがあります。それは日常的に針が鋭い維持することが重要です。 このプロトコルでは、伝統的な、GAL4-UASシステムを使用してグリアプロセスの可視化と並行して神経網を可視化するためにハエのタンパク質トラップラインを利用しました。これらのツールはまた、LEなど他のバイナリの発現系と組み合わせることができるGAL4の独立しているXA 19とQ-システム20。これは、損傷に応答して、軸索とグリア突起の間に例えば相互作用の解析を可能にするでしょう。さらに、樹状突起21又はカルシウム流入22の記者のような他の遺伝学的ツールを組み合わせることで、この方法は、CNSのグリア細胞、神経軸索と樹状突起の傷害応答の背後細胞生物学を分析するための絶好の機会を提供しています。最後に、この方法は、傷害と再生への応答における遺伝子機能をテストするために、標準的な遺伝学、突然変異や遺伝子の過剰発現と組み合わせることができます。 このプロトコルは、正常にCNS傷害11〜回生グリア応答の根底にある遺伝子ネットワークの発見につながっている。これらの細胞事象とフルーツハエの遺伝子の機能を解明し、遺伝子機能の進化的保存性考えるとミリアンペアの理解に重要な洞察を提供しそうです傷害と再生へmmalian CNSのレスポンス。

動物での再生は、細胞が生物の成長を注文し、完了したときに感知する方法、および構造的完全性生物の達成と維持されていることが明らかになった。細胞のこれらの神秘的な能力を理解することは、生物学における大きな関心事である。再生を促進することは医学的神経科学のための主要な目標の一つです。ヒトでは、損傷した中枢神経系（CNS）が再生成されません。脊髄損傷の齧歯類モデルは、細胞が傷害に応答する方法を理解するために使用されています。しかし、倫理的な問題、コストの高さや動物のスローライフサイクルが進行を抑制する。 フルーツショウジョウバエは、発生生物学、神経科学で広く使われているモデル生物である。その強力な遺伝学的ツールと短いライフサイクルのおかげで、 ショウジョウバエは、反復的に、人間と病気の理解に関連性を持つ遺伝子の機能や遺伝子ネットワークの発見につながっている。進化詐欺の豊富な証拠があるヒトへのハエから遺伝子機能の保全。 近年、神経系損傷のためのいくつかのパラダイムはショウジョウバエにおいて確立されている。いくつかは、感覚1とモータ2軸索を含む末梢神経の軸索に沿って翼や実行末梢神経を損傷することで構成されています。しかし、末梢および中枢神経系は、多くの点で異なっており、それは、多くの動物では、末梢神経系は、中枢神経系ができないのに対し、再生成することが知られている。このように、中枢神経系の再生を理解するために、中枢神経系への直接傷害がより適切です。針で刺すような傷害が正常にけが3,4への応答を調べるために、ショウジョウバエの成体脳に適用されています。別のアプローチを使用して、Ayaz ら切断された中枢神経系のピエゾパワーmicrodissector培養した成人の脳の軸索し、4 日のために彼らの再生を分析した。これらの後の実験的な集合Uの利点psのは、彼らが大きな関心を集めて間違いなく脳に焦点を当てることです。欠点は、脳が運動感覚制御のみを扱い、VNC、より多く、より複雑であるということです。成体脳での作業もより時間がかかります。それが羽化のために約10日ほどかかり、その後それらの成熟のためにさらに5日間のに対し、幼虫は、4日間の実験の準備ができています。それを除去することが困難である厚いクチクラでカプセル化されているため、成人の脳は、処理するためにも、より難しいです。 VNCは、脊椎動物の脊髄と機能的に同等であることの更なる魅力を持っています。 ショウジョウバエの幼虫は、広く神経科学6-9モデル生物として使用されます。厳密に言えば幼虫発育段階にあるが、それはまた、完全に機能的な動物と見なすことができます。幼虫は歩行、嗅覚、味覚や痛覚などの複数の感覚、学習や記憶を持っています。このように、幼虫のVNCワットCNS損傷のための理想的なモデルとして選択として。 幼虫と蛹VNCsは依然として最大24時間、10〜のために細胞の完全性を維持し、皿に解剖し、培養することができる。これは、怪我は、その後、この期間以上にわたり、時間経過に記録することができ、VNC、に適用される、またはこの期間内の任意の時点で培養し、修正される可能性が示唆された。 ここでは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCを使用してCNS損傷のための実験パラダイムを提示する。 VNCは第一幼虫から解剖され、刺すような損傷はタングステン針を使用して手動で適用されます。 VNCはその後グラスボトムカバースリップ上に置き、共焦点顕微鏡タイムラプスレーザーで撮影されています。あるいは、VNCsは所望の期間培養することができ、怪我の細胞効果は、免疫染色し、共焦点顕微鏡を用いた固定標本で解析することができます。創傷面積を測定し、細胞Nuの定量分析することができますmber（細胞増殖と細胞死）が意図的に開発されたソフトウェアを用いて行うことができる。大きなサンプルサイズが容易に統計学的に検証された結果で、その結果、処理することができます。これらのメソッドは正常にCNS傷害11〜グリア再生反応の根底にある遺伝子ネットワークを発見するための強力なショウジョウバエ遺伝学と統合されました。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>染色ブロック</td><td>ブルネル顕微鏡</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子5号</td><td> 例えばファイン科学ツール</td><td> 例えば 11251から20 </td><td></td></tr><tr><td>タングステン針：棒の直径は0.5mm、先端のサイズは1μm、長さ2インチ</td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-6065 </td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-6060 </td><td></td></tr><tr><td> Arkansans石：デュモン鉗子の修理キット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 29000から00 </td><td></td></tr><tr><td> 27ミリメートルのガラスベースで35ミリメートルペトリ皿</td><td>いわき市</td><td> 3930-035 </td><td></td></tr><tr><td>環境室とライカSP2-AOBS焦点倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>シールドとサンヒョンM3昆虫培地（エクジソン無料） </td><td>シグマ</td><td> S3652-500ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水（PBS） </td><td> 12を参照してください</td><td></td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>シグマ</td><td> F7524 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>シグマ</td><td> P1399-25MG </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、10％、メタノールフリー、超純</td><td>ポリサイエンス</td><td> 04018から1 </td><td></tD&gt; </tr><tr><td>マウス抗グルタミン合成酵素抗体</td><td>ミリポア</td><td> MAB302 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗GFP抗体</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> A11122 </td><td></td></tr><tr><td>マウス抗REPO抗体</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク</td><td> 8D12 </td><td></td></tr><tr><td>ラット抗ELAV抗体</td><td>発達研究ハイブリドーマバンク</td><td> 7E8A10 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗活性カスパーゼ3抗体</td><td>アブカム</td><td> ab13847 </td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギのAlexa Fluor 488 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> A11034 </td><td></td></tr><tr><td>抗マウスのAlexa Fluor 647 </td><tD&gt;ライフテクノロジーズ</td><td> A21236 </td><td></td></tr><tr><td>抗ラットのAlexa Fluor 647 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> A21247 </td><td></td></tr></tbody></table>

an injury paradigm to investigate central nervous system repair in drosophila

実験方法は、フルーツフライショウジョウバエを用いた中枢神経系（CNS）損傷に対する細胞応答を調べるために開発されました。動物での修復および再生を理解することは、生物学の重要な問題である。損傷したヒトCNSは再生成し、再生を促進する方法を理解することは、医学的神経科学の主な目標の一つであることはありません。 ショウジョウバエの強力な遺伝子ツールキットは、中枢神経系再生の問題に取り組むために使用することができます。 中枢神経腹側神経索に病変は（VNC、脊椎動物の脊髄に相当）のタングステン針を使用して手動で適用されます。 VNCは、その後時間をかけて病変の発達をフォローアップするために24時間のためにレーザー走査共焦点顕微鏡を用いてタイムラプスで撮影することができます。あるいは、それは固定され、共焦点顕微鏡で神経細胞やグリア細胞を可視化する蛍光抗体を用いて染色し、培養することができる。 chaは、適切なマーカーを使用して傷害の結果として、細胞の形態や細胞の状態でNGESを可視化することができます。 ImageJのととわざわざプラグインを開発し、定量的·統計的分析は時間と細胞増殖と細胞死の傷害の影響の上に傷の大きさの変化を測定するために行うことができる。これらの方法は、大きなサンプルサイズの分析を可能にする。彼らは、CNS再生および修復の分子機構を調べるために、ショウジョウバエの強力な遺伝学と組み合わせることができます。

ここでは、 ショウジョウバエの幼虫のVNCに刺すような傷害を行い、時間経過を用いて、共焦点蛍光顕微鏡を免疫染色傷害に対する細胞応答を分析する方法を示しています。 タイムラプスデータでは、病変はG9軸索のマーカー（ 図2）を有する標本の神経網内のGFP陰性領域として可視化される。刺殺後まもなく、小さなGFP陰性領域、穴または液胞のように見えます（ 図2A）現れ始めます。 GFP陰性などの分野は、一般的に（ 図2A）刺殺後に8から6の周りに時間まで拡大します。 （ 図2B）続いて、GFP陰性領域は縮小しても消えることがあります。 22刺殺後のHRによって、傷が占める面積は、一般的に最大の面積よりも小さくなっている（ 図2A、B）を刺殺後6〜8時間であった。同様にグリア突起でのDsRed陰性領域は当初、あまりに増えますが、shrin刺殺後22時間、カンザス。興味深いことに、しばしばDsRedの陽性グリアプロセスが彼らの前に失踪（ 図2C）に神経網におけるGFP陰性の穴を埋める。 固定標本​​で免疫染色を用いて、微細なグリア突起やけがへの彼らの応答はタイムラプスイメージを持つより良い分解能で可視化することができる。これは、すべてのグリア細胞（グリア正中線を除く）を可視化するためにハエにおける膜繋留レポーター（ 例えば UAS-mCD8GFP）の発現を誘導することがrepoGAL4グリアドライバを使用して、例えば、実行することができます。これはまた、神経網に関連するグリア細胞（ 図3A、B）ラベル抗GS2などの他のグリアマーカーと組み合わせることができます。ここでは、腹側神経索が腹側に凹み（ 図3A、矢頭）に傷害の結果を刺し、背側から刺しているがことを示している。刺すようにもっと厳しく神経網と神経網関連グリア細胞番目に影響を与えるように見える表面および皮質グリア細胞（ 図3B）。グリア突起は、彼らはまだ皮質の組織のように自分のメッシュを維持する一方で、神経網の混乱が表示されます。残骸の破片のように正常な細胞とは区別されGS2陽性細胞の破片で負傷の結果は非常に小さく、電池本体に接続されていない。これは、神経網関連グリア細胞（ 図3B）への損傷を明らかにする。変性神経網関連グリア細胞は、電子顕微鏡15で観察した。抗切断さカスパーゼ3 +アポトーシス染色は、彼らが怪我を刺した際にアポトーシスを示す、神経網に関連するグリア細胞15に観察される。神経網関連するグリア細胞は神経細胞の破片15を貪食することが示された、とGS2 +信号はまた、グリア突起によるアポトーシスニューロンの貪食を明らかにするかもしれない。切断されたカスパーゼ+アポトーシス細胞はまた、（少なくともElav +ニューロンに対応するそのうちのいくつかは、皮質で観察される<strオング&gt;図3C）。 固定された試料を用いて、免疫染色してもそのような増殖とアポトーシスの効果として、傷害に対する細胞応答の定量的な分析を可能にします。このため、我々は意図的に、それぞれ自動的にグリア細胞とアポトーシス細胞の数をカウントするために、2 ImageJのプラグイン、DeadEasyカスパーゼの幼虫とDeadEasyグリアを開発しました。彼らは幼虫VNCs上で動作するように検証され、非常に正確であるされています。これらの使用して、それは22時間（ 図4A）15によって、刺す傷害によって引き起こされるREPO陽性グリア細胞の数の増加を観察することができる。 6時間後の刺殺（ 図4B）15による抗切断されたカスパーゼ-3アポトーシス細胞数の増加もあります。 ショウジョウバエ中枢神経系の損傷に応答して、グリア増殖とアポトーシスのような増加は、脊椎動物の中枢神経系における傷害応答を彷彿とさせる。 このプロの重要な側面トコールはVNC解剖の品質です。 VNCsがプロセス中に損傷されたか否かを解剖時に見分けるのは困難です。穏やかな解剖を実行するために特定の世話をすることが重要です。しかし、質の悪いサンプルは必然的に生産され、それが、これらは後の段階で特定され、破棄されることが不可欠であることでしょう。我々の手には、VNC変性が怪我とは無関係のように見えるのではなく、ラフ解剖によって引き起こされる。私たちは、怪我の傷で臨界サイズは確認されていません、我々は劣化していないすべての傷ついたサンプルを分析する。 VNCsの整合性を維持する場合には、VNCの表面は滑らかで光沢の見える傾向があり、神経網に穴が（ 図5A）が観察されていません。 VNCsの劣化がVNCの腹と横の領域（ 図5B）の粗面から24時間後の解剖によって認識することができます。刺す傷害とは関係のない神経網の劣化も発生することがあります、それは神経網hとして認識されている免疫染色標本のバックグラウンドシグナルのoles。変性のこれらの徴候を有する試料（ 図5C）を捨てなければなりません。我々の手で、無傷で刺さ制御（YW）ハエの解剖や怪我の成功率は、両方の約70％である。この速度は、実験を行う人のスキルに応じて変化し、遺伝子型となります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig1.jpg" /> 図1。幼虫のステージングと刺す傷害の模式図。（）0日目に、ハエは3時間グレープジュースペトリ皿に卵を産むために許可されています。 1日目、孵化1齢幼虫（L1）が収集され、それらは別の3日間保持されている標準のイーストフードを含むバイアルに入れ。 4日目に、幼虫は食物バイアルから収集され、刺すような実験のために使用。幼虫の中枢神経系（B）は側面図を。腹神経索の腹部は背側から針で刺されています。前方は左に、右後方に。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig2.jpg" /> 図2。 VNCの病変の経時的進行。GFP標識軸索およびDsRed標識グリア細胞とのライブVNCs上の共焦点顕微鏡。遺伝子型：UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / +（A）の病変は軸索の神経網に蛍光の欠如によって認識されています。刺殺後、GFP陰性の穴が、その後大きさと数を増し、表示されます。刺殺後の9時間から傷害を刺した後の各時点から5光学部の突起が。（B）は軸索の神経網病変が縮小。これらの画像は、けがを刺した後の異なる時点から単一の光学切片です。各試料中の同等の位置、eaから同じスライス番号を識別するにはタイムラプスデータのスタック内のchの時点が選ばれました。刺殺で影響を受けない領域でG9とrepoGAL4&gt; UASmCD8GFPで可視化したパターンを比較することにより、スライスがZ軸で同等の位置からのものであると確認した。の破線は、（A、B）は傷の縁を表しています。神経網の傷（C）の高倍率。 GFP陰性穴がDsRedの陽性グリア突起で埋め、その後（矢じり）消失した。水平方向のビュー。前方まで。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig3.jpg" /> 図3。 VNCの病変の細胞特性評価。抗GFP及び抗GS2、神経網に関連するグリア細胞のマーカーで染色したすべてのグリア細胞（グリア正中線を除く）の膜係留GFPレポーターを冠しVNCs。遺伝子型：+ / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / +（A）VNCsはDORから刺されたサル側が、これは腹へこませる（矢頭）。単一の光学切片のサジタルビュー、最大背部および前部左側。（A、B）は刺し損傷は皮質表面とグリア細胞より厳しく神経網に関連するグリア細胞に影響を与えます。 GS2陽性細胞の破片で負傷の結果（Bの矢印）。単一の光学切片（B）の水平方向のビュー、前方まで。矢じりはGS2を指す+細胞破片を（C）アポトーシスマーカー抗切断さカスパーゼ-3および神経マーカー傷害によって皮質の死細胞のいくつかは、ニューロンがあることを示す抗ElavのColocalisation。 NP、神経網、CX、皮質。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig4.jpg" /> 図4。 DeadEasyを使用してグリア細胞とアポトーシス細胞の自動カウント。REPOが正カウントする&#39;DeadEasy幼虫グリア&#39;を使用しての（）例グリア細胞。左：抗REPO抗体で染色し、VNC腹半分、真ん中：プラグインによって同定された細胞を示すDeadEasy幼虫グリアからの出力、右：マージは。右側の数字は、約30秒での光共焦点セクションのスタック全体で自動的にカウントREPO陽性細胞の数です。刺さVNCsにおけるグリアの数が増加する。 &#39;DeadEasyカスパーゼ幼虫&#39;を使用して（B）の例。左：抗切断されたカスパーゼ3抗体で染色し、共焦点光学5節の突起;真ん中：プラグインによって同定された細胞を示す出力、右：マージ。右側の数字は、約30秒での光共焦点セクションのスタック全体で自動的にカウントカスパーゼ陽性細胞の数です。アポトーシス細胞の数が刺さVNCをして増加する。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50306/50306fig5.jpg" /> 図5。 degeneratの例イオン（A）健康なVNC。変性の兆候はありません。（B）は胸郭の側が刺さ検体中の変性（矢印）です。アスタリスクは、病変部位を示します（C）胸部神経網に穴（白矢頭）と皮質（オレンジ矢印）VNC非刺さインチ損傷した神経網と豊富な空胞変性を有する試料を捨てなければなりません。ここVNCsは神経網関連するグリアマーカー抗エボニーで染色した。水平方向のビュー、前方まで。

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An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用されます。

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

an-injury-paradigm-to-investigate-central-nervous-system-repair

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

13.2K ビュー.  University of Birmingham. 中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用さ?...

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Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

神経科学

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

齧歯中枢神経系への薬物の直接脳室内デリバリー

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

パッシブCLARITYを使用したマウス中枢神経系の光学クリア

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are limited resources directing scientists in the techniques for measuring and analyzing these variables. This protocol describes the methods for measuring RSNA and mean arterial pressure in anesthetized rats. The protocol also includes the approaches for accessing the brain during RSNA recordings for central nervous system (CNS) manipulations. The RSNA recording technique is compatible with pharmacologic, optogenetic, or electrical stimulation of the CNS. The approach is useful when an investigator will measure short-term (min to h) autonomic responses in non-survival experiments to correlate anatomically with CNS nuclei. The approach is not intended to be used to obtain chronic (survival) recordings of RSNA in rats. Discharges in RSNA, averaged rectified RSNA, and mean arterial pressure can be quantified and analyzed further using parametric statistical tests. Methods for obtaining venous access, recording mean arterial pressure telemetrically, and brain fixation for future histological analysis are also described in the article.

Methods for measuring sympathetic and cardiovascular responses to central nervous system (CNS) manipulations are important for advancing neuroscience. This protocol was developed to assist scientists with measuring and quantifying acute changes in renal sympathetic nerve activity (RSNA) in anesthetized rats (non-survival).

麻酔下ラットの中枢神経系の操作への応答での腎交感神経活動の急性変化の定量

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...