このプロジェクトは、ジョンズ·ホプキンス大学、 ゲートウェイ科学イニシアティブを通じて学長のオフィスによって部分的にサポートしました。

<ol><li>容器のセットアップを使用して操作を開始します。従来の発酵槽（ 図1）をインストールする必要のある次のコンポーネントがあります。 <ol><li> pHプローブ - ライブ、培養中のpHの測定のために。インストールの前にプローブを校正し、容器を滅菌する。ヘッドプレートにプローブを取り付けます。 </li><li>のpO 2プローブ-発酵中の容器内の溶存酸素量の測定のため。ヘッドプレートに取り付けます。 </li><li>文化をサンプリングするための収穫パイプ。ヘッドプレートは、この高さ調節が可能なコンポーネントをインストールします。 </li><li>ガススパーは - 容器の底に存在し、文化へのガス注入を提供します。発酵槽でのガス源にスパーを接続し、ヘッドプレートにマウントします。 </li><li>インペラシャフトとインペラ - インペラは文化を撹拌し、容器内の培養均一性を維持するために重要である。 </li><li>排気ガス冷却器 - 排気ガス通路を冷却することによって容器内の蒸発損失を抑制するための。 </li><li> pH制御や飼料添加のための試薬ポンプライン。 </li></ol></li><li>容器をきれいにし、石鹸と水でヘッドプレート。柔らかいブラシは、容器とヘッドプレートを洗浄するために推奨されている。塩素漂白剤や洗剤は、容器を洗浄するために使用することはできません。 </li><li>メディアは不安定な熱されていない場合は、清浄な容器に追加します。最大使用量に到達するまでにのみ追加します。この場合、最大使用量を5 Lの総容積容器3.3 Lである。 </li><li> Oリングシールが正しく取り付けられていることを確実にする、血管のヘッドプレートを取り付けます。 </li><li>排気ガスコンデンサーを取り付けます。 </li><li>その10ミリメートルポートに消泡プローブを取り付けます。 </li><li>その10ミリメートルポートに収穫パイプを取り付けます。その上に、チューブの部分を入れて、それを固定します。 </li><li>散布口にチューブと0.20μmのフィルターをインストールしてから、これをオフにクランプします。 </li><li> pHプローブを校正： <ol><li> 2小さなビーカー内のリファレンス·バッファ、洗浄瓶、スペアWAを集めるSHビーカー。 </li><li>発酵槽にpHプローブを上にフックし、発酵槽、電源を入れます。 </li><li> pHのパラメータにスクロールして、メニューボタンを使って、「カル」オプションまでスクロールし、「Enter」キーを押し。 </li><li> 2点校正のための&#39;2 &#39;を選択します。 </li><li>プローブ先端を洗浄し、低基準バッファに沈める。発酵槽での値が安定します。 +を使用し、 - キー、pH比較バッファの値と一致するように表示される値を調整します。それが点滅を停止したら、「Enter」キーを押し。 </li><li>オフプローブを洗浄し、第二のリファレンス·バッファに挿入します。値が安定してから表示される値が高いリファレンス·バッファの値と一致しているように、キーパッドを使用することができます。押して確認しEnterキーを。 </li><li>プローブ先端を洗浄し、発酵槽から外し。接続時に保護キャップを入れて、ヘッドプレートに取り付けます。 </li></ol></li><li> pO 2がプローブ先端を開き、そこに次のことを確認するためにチェックするチップを覆うために十分な電解質がある。そうでない場合、リザーバーにいくつかを追加して、それを閉じるBack。 </li><li>ヘッドプレートにはpO 2プローブをインストールし、オートクレーブキャップは、その電気的接続を保護するために装着されていることを確認してください。これは、滅菌後に校正されます。 </li><li>ディップチューブ、エアフィルターと試薬の供給のためのボトルを取得します。ディップチューブポートにポンプチューブを追加し、発酵槽に流入ポートにもう一方の端を取り付けます。 </li><li>すべての未使用のポートの上に置いてチューブを入れ直しチューブクランプ。 </li><li>排気ガスコンデンサーに0.45μmのフィルターを取り付けます。このフィルタは、容器がオートクレーブ内で加圧しないことが保証されます。 </li><li>メディアのレベルを下回るすべてのチューブが出てくるからメディアを防ぐために、オフにクランプされていることを確認してください。 </li><li> 121℃、液体サイクルで30分間 - 25オートクレーブに容器を置きます。注意：それが出て来ると、それは非常に熱くなります。 </li><li>発酵槽ベースに容器をインストールします。 </li><li> pHをつなぐケーブルを探る。 </li><li>のpO 2プローブケーブルを接続します。 </li><li>ガス添加ロータメータにスパーを上に引っ掛けます。 </li><li>無菌ディップチューブをボトルに1MのNaOH試薬を追加し、基本ポンプヘッドスピンドルにポンプヘッドを取り付けてください。 </li><li>ヘッドプレートにサーモウェルに温度センサーを置く。それはサーモウェルの底に道のすべてを行くことを確認してください。 </li><li>船インペラカップに攪拌アームを下げます。 </li><li>発酵槽がオンになっていることを確認してください。 </li><li>水は発酵槽に使用可能であることを確認してください。 </li><li>発酵槽への空気供給をオンにします。 </li><li>温度パラメータまでスクロールし、37℃に温度を設定温度制御を開始するためのボタンをEnterキーを押します。容器は15分以下に熱くなる。 </li><li>分以下のメディアの1容器容積へのガス流をオンにします。このセットアップのために、ガス流は3リットル/分である。気泡が一番下に表示されます。 </li><li>攪拌Pまでスクロールarameterおよび300 rpmに設定してください。 Enterキーを押して、攪拌をオンにする」と入力します &#39;。 </li><li>温度が37℃に達した後、pHをパラメータにスクロールして6.8に設定します。 「入力」ボタンを押して、pHコントロール、電源を入れます。 </li><li>実行の1,000 rpmで最高速度に攪拌を設定します。 </li><li>はpO 2プローブは、適切な値を表示するために適切に偏光していることを確認してください。 2時間後のPO 2パラメータまでスクロールし、「キャリブレーション機能」を選択し、1点校正を選択するには「メニュー」ボタンを使用します。 </li><li> 15分後、100を押して値を設定するために、カーソルを使用」と入力します。 &#39;これはのpO 2を校正します。 </li><li>撹拌にスクロールして、300 rpmに設定してください。 </li><li> 「メニュー」ボタンを使用して、中の攪拌メニュー &#39;on&#39;に &#39;カスケード」をオンにします。これは、気泡を切り刻む成長需要が増加するにつれて、溶液中に多くの酸素を強制する目的で、攪拌の速度を増加させる。 </李&gt; <li> pO 2がパラメータにスクロールし、値を30に設定してください。 pO 2が開始する「入力」ボタンを押してください。 </li><li> PC上の制御ソフトウェアパッケージを開始します。 </li><li>プローブが校正されると、攪拌を300rpmで安定している、温度は37℃であり、pHは6.8に近く、それは接種するための時間です。アルコールを用いて、接種に使用するポートを滅菌する。 </li><li>注射器に接種物を描画し、滅菌ポートに追加します。ポートを閉じる。 </li><li>ログブックに接種時をマーク。 </li><li>これは、滅菌時間でサンプルを取ることも重要である。アルコールと収穫管管の端部を滅菌する。 </li><li>収穫ポートをカバークランプを開き、サンプルを描画するための注射器を使用しています。それがパイプに座ってきたので、この最初のサンプルは、通常、廃棄される。 </li><li>別のサンプルを引っ張って、別の注射器を使用してください。 </li><li>第三の注射器で、できるだけ多くのデッドボリュームを削除するために、パイプを通って空気を押し出すラインからラインをオフにクランプします。 </li><li>細胞密度およびpHを測定し、値を記録。微生物培養により、値が1時間ごとにログに記録するのに便利です。間隔は文化に依存しています。 </li><li>成長が完了した後に収穫の方法論は、培養のために意図によって異なります。この場合には、培養の細胞密度および湿潤細胞重量の可能なpHまたは測定のためのエンドポイント値を受信するための最終的な時間をサンプリングする。漂白剤や他の抗菌剤との指定された「キルタンク」内のコンテンツ処分ヘッドプレートを開きます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).</li><li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing.">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li><li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor,+Monitoring,+Modeling+and+Simulation.">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li><li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1:+Identifying+a+Formulation.">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li><li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li><li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan,+a+bioengineered+heparin+precursor.">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Minifors operating Manual and user guide. , .</li></ol>

著者A.マグノは、この記事で使用した試薬や器具を生産ATRバイオテックの従業員である。

攪拌タンクバイオリアクターは、バイオテクノロジー業界の標準であり、40年以上の1のために使用されている。小さな撹拌槽は、スケールアップ、スケールダウン、歪みの最適化、特性評価、およびプロセス開発のために重要であった。また、個別化医療2の開発において重要な役割を有することができる。それはランを通してモニターし、最適化することができるので、小規模のバイオリアクターは、細胞増殖のためのインサイチュー条件のに最も類似している。ほとんどの場合、最初の実験は、振盪フラスコを使用して実行されるが、小規模のバイオリアクターの条件は、振盪フラスコとは大きく異なる。 1実験では、 大腸菌の最適な成長のための条件ことを発見大腸菌および振とうフラスコ内の緑色蛍光タンパク質（GFP）の製造は、撹拌槽（未発表データ）に変換しなかった。 大規模に増殖する細胞の他の方法は、ローラーボトル、単一のuを含むSE 50〜5,000 Lからプラットフォームのバイオリアクター3と作業ボリュームを持つ大規模単回使用バイオリアクターロッキング各メソッドは、スケールアップのための課題を提供していますが、生産の場所を見つけました。プラットフォームのバイオリアクターロッキング回の使用は、撹拌槽に類似しており、規制環境を提供します。それは細胞の沈降を防止し、酸素化を提供するために波を発生させるための揺動運動を発生することで、混合攪拌槽と異なる。この方法のための流体力学は、攪拌タンク異なり、最大容積1,000 L.に限定される差異は、細胞増殖および生成物の産生に影響を与えることができる。他のシングルユースシステムは、インフラストラクチャおよび関連するオーバーヘッドを最小限に抑えながら、プラットフォームを提供するために、使い捨ての反応容器と撹拌槽を組み合わせて、高スループットのための機能は、4をバイオプロセス。 ベンチトップリアクターの新規ユーザーは、トラブルのpHのPO 2の初期設定値を決定し、TEMを持っている可能性peratureが、発表された研究は、この情報5、6、7、8、9のために参照することができる。特に細菌培養では、振とうフラスコと同じ設定温度と同じ速度で攪拌を開始することをお勧めします。以前の振盪フラスコランからの培養pHも出発点として使用することができる。のpO 2値の設定がより困難であり、典型的には経験的に決定される。しかし、50％のpO 2以降では推奨される出発点である。

基本的な発酵技術は、培養物を成長させるための単純な振盪フラスコ法の拡張である。それは、より完全かつ定量的な方法で生きた培養のための成長環境を制御したいという要望から生まれました。バッチ培養振とうフラスコは、通常、温度の不正確な制御によって制限されています。インキュベートシェーカーや暖かい部屋の温度の均一性は時々意図された目標値から5℃以上を逸脱、非常に可変である。振とうフラスコは、通常、一定速度で撹拌されるので、酸素摂取量およびガス交換が制限される。利用可能な周囲の酸素が枯渇したら、ほとんどの文化が繁栄することができない。振盪フラスコ内にpH制御は存在しない。培養物を供給原料に限定されるものではない場合に多くの場合、それは培養物に不利益点まで酸性になり、呼吸が劇的に遅くなる。ほとんどの振とうフラスコ培養はまた、彼らはinoculatioまたは文化の最初の方に一度だけ送られることを意味し「バッチ」として経営されていますN。この最初の炭素源が消費された後、培養物は成長が止まる。いくつかの場合において、その代謝はシフトし、培養液中に他の代謝産物を消費し始め、時には得られたバイオマスまたはタンパク質の特性を変更することができる。フラスコを37℃で、通常、24時間あたりの体積の通常10％の温暖な培養環境におけるメディアの蒸発損失の対象と振るこの損失は、文化の密度を変化させ、システムの長期的な操作を禁止している。最後に、ユーザーは、攪拌した後、メディアからの発泡が発生する場合があります。文化上のヘッドスペース中の泡の発生はガス交換し、さらに膝の成長を制限することになる。 基本的な発酵システムは、これらの制限のすべてに対処するように設計されている。慎重な温度制御は、インペラ攪拌および加熱ジャケットを用いて発酵容器で達成される。通常、このジャケットの加熱と冷却の容器とフィードバックコントロールに挿入されたセンサセットポイントの周り0.1℃±温度制御をもたらす。卓上型の発酵槽は、一般的にポンプを介して液体試薬添加によりpHを制御することができます。 pH値を連続的に細胞増殖のための最適な環境を維持する目的で監視される。適切な通気は、上記混合羽根によって、または培養物中に直接ガスを補充した空気または酸素の注入によって維持される。せん断に敏感な文化と、酸素を補充したガスは、培養中の酸素レベルを維持するための主要なメカニズムである。溶液中の酸素の測定は、通常、振盪フラスコ中で使用するのに通常は利用できないポーラログラフプローブによって達成される。これは、連続的または周期的に直鎖状または指数関数的成長を維持するために容器にフィードを追加することも可能である。出口ガス冷却器は、このように培養液量と濃度を維持し、凝縮する排気ガス流中の蒸気のための低温表面を提供する。消泡剤、界面活性剤の定期的な添加は、アクチュエートされている表面に泡を低減し、ガス交換を可能にする、培養中の導電率プローブによる。 容器は、全てのプローブ、付属品、インペラー、収穫パイプ、チューブで、組み立てと標準オートクレーブ滅菌。最終プローブ校正および動作環境に安定した後、培養容器に添加する。次に、システムは、振とうフラスコ法に比べてより定量的かつ正確な方法で培養物を特徴付けるために使用することができる。温度、pH、酸素含有量、飼料摂取量、液体の蒸発、及び泡のレベルの厳密な制御は、すべてのはるかに高いバイオマスおよび良好タンパク質収量に寄与する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="356">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">ampicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A1593-25G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">antifoam 204</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A8311</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1 M Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>38215-1EA-R</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 4.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B5020</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 7.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B4770</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">pO2 probe electrolyte</td>
			<td style="width:117px;">Broadley James</td>
			<td>AS-3140-C30-0025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.45 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-02915-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.22 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-29950-40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Luer Lock syringe, 10 mL</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-07940-12</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Minifors Bioreactor</td>
			<td style="width:117px;">Infors HT</td>
			<td style="width:117px;">B-Pack 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Air Admiral air pump</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-79202-00</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1175 PD Chilling circulator</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td style="width:117px;">13721-204</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

operation of a benchtop bioreactor

発酵系は、細胞培養物の多くの異なるタイプのための最適な成長環境を提供するために使用される。慎重に温度、pH、特に溶存酸素濃度を制御するための発酵槽によって与えられる機能は、効率的な大規模な増殖および発酵産物の発現にそれらが不可欠となる。このビデオでは、簡単に振とうフラスコ上で発酵槽の利点を説明します。また、一般的なベンチトップ発酵システムの重要な構成要素を特定し、そのプローブの容器やキャリブレーションの設定に基本的な指示を与える。視聴者は、滅菌プロセスに慣れ、培養容器中で増殖培地に接種する方法を示す。運転、サンプリング、および収穫の基本的な概念も実証される。簡単なデータ分析やシステムのクリーンアップについても説明します。

バイオリアクターは、IRISソフトウェアの有無にかかわらず実行することができます。ただし、データをキャプチャするために、ソフトウェアを使用することをお勧めします。細菌の添加前に、pHおよび酸素センサは、インペラー速度セット及び温度設定を較正しなければならない。 図2において、バイオリアクターランのデータ出力が提示される。温度を30℃、200rpmのインペラ速度に設定した。パラメータは、各実験ごとに異なる​​かもしれないが、細菌の添加前に、システムが定常状態にあるべきである。 図3において、細菌培養物を添加した酸素濃度の変化が示されている。この実験のための設定点を37℃、200rpmで攪拌機70％のO 2である。時間19:20、供給ポンプはすぐに、O 2レベルの低下の原因0.1のODで細菌種培養を実現します。バイオリアクターは、空気の流れと羽根車の速度の増加に伴って変化するO 2レベルに応答します。 T増加する彼が設定点は​​、カ​​スケード（ステップ35）で設定されている。反応器のpHは、pHは、経時的なpHライン変動（ 図4）によって示されるように増加し、その後減少に伴って、リアルタイムでモニターした。ラン全体を分析することができ、パラメータは、その後の実験のために調整。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> 図1。標識され、接続されているすべての部品とのベンチトップバイオリアクターは、この図では、実行開始時の攪拌タンク反応を示しています。反応器の部品を標識し、センサー、羽根車、温度計、フィード·サンプリングボトル、排気口、空気圧力計、加熱マントル、凝縮塔、およびコントロールパネルが含まれる。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> 図2。バイオリアクターSOFの画面イメージ実行の開始時にtware。撹拌槽実行の開始時に、温度を30℃（黄色の線）に設定し、200回転（赤線）、6.5（緑の線）でのpH、及びPO 2のインペラ速度57.2％（青線）で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> 図3。酸素が ​​減少するにつれて、実行中のバイオリアクターソフトの画面イメージ。培養物は、活性成長期にある場合、それは酸素を消費し、反応器内の酸素量が減少する（青い線）。インペラー速度を上げることにより、より多くの酸素を培養（赤線）に追加することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 図4。時間をかけてpH変化を示すバイオリアクターソフトウェアの画面イメージ。培養物のpHを連続的に監視され、乳酸が生成されるように時間をかけて、それが減少した後、基材としての増加は、バイオリアクター（青線）に追加されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。

Watch this Scientific Journal Video about Operation of a Benchtop Bioreactor at JoVE.com

Operation of a Benchtop Bioreactor

発酵槽は、生物工学、細胞の培養の収率および生産性を高めるために使用される。振盪フラスコ内で複数の微生物または動物細胞培養候補をスクリーニングした後、次の論理ステップは、選択された発酵槽培養物のバイオマスを増加させることである。このビデオでは、一般的なベンチトップ型バイオリアクターシステムのセットアップと操作を示しています。

ベンチトップリアクターの操作

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

88.6K ビュー.  Johns Hopkins University. 発酵槽は、生物工学、細胞の培養の収率および生産性を高めるために使用される。振盪フラスコ内で複数の微生物または動物細胞培養候補をスクリーニングした後、次の論理ステップは、選択された発酵槽培養物のバイオマスを増加させることである。このビデオでは、一般的なベンチトップ型バイオリアクターシステムのセットアップと操作を示して?...

ビデオ: Operation of a Benchtop Bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

拍動バイオリアクターを用いた工学生物学ベースの人工血管

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

生物工学

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

新規声帯バイオリアクターの構築とキャラクタリゼーション

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

使い捨て空気圧バイオリアクターシステムを使用して、哺乳動物細胞の培養

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

多様な微生物群集の高密度栽培のための新しいバイオリアクター

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

細胞への分子化合物の送達を強化するためのアキュトー流体デバイスの組立と操作

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This paper presents a cleanroom "light" fabrication process of carbon fiber neural electrode arrays that can be learned quickly by an inexperienced cleanroom user. This carbon fiber electrode array fabrication process requires just one cleanroom tool, a Parylene C deposition machine, that can be learned quickly or outsourced to a commercial processing facility at marginal cost. This fabrication process also includes hand-populating printed circuit boards, insulation, and tip optimization. 
The three different tip optimizations explored here (Nd:YAG laser, blowtorch, and UV laser) result in a range of tip geometries and 1 kHz impedances, with blowtorched fibers resulting in the lowest impedance. While previous experiments have proven laser and blowtorch electrode efficacy, this paper also shows that UV laser-cut fibers can record neural signals in vivo. Existing carbon fiber arrays either do not have individuated electrodes in favor of bundles or require cleanroom fabricated guides for population and insulation. The proposed arrays use only tools that can be used at a benchtop for fiber population. This carbon fiber electrode array fabrication process allows for quick customization of bulk array fabrication at a reduced price compared to commercially available probes.

Here, we describe fabrication methodology for customizable carbon fiber electrode arrays for recording in vivo in nerve and brain.

オープンソースツールキット:神経記録用のベンチトップカーボンファイバーマイクロ電極アレイ

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

バイオエンジニアリング気道組織を生成するためのイメージング誘導バイオリアクター

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...