Este proyecto se apoyó en parte por la Universidad Johns Hopkins, Oficina del Rector a través de la Iniciativa Científica Gateway.

<ol><li> Comienza la operación con la instalación del vaso. Un fermentador convencional tiene los siguientes componentes que necesitan ser instalado (Figura 1): <ol><li> sonda de pH - para la medición de pH en el cultivo vivo. Calibrar la sonda antes de la instalación y esterilizar con el buque. Instale la sonda en la placa superior. </li><li> PO 2 de la sonda - para la medición del contenido de oxígeno disuelto en el interior del buque durante la fermentación. Instalar en la placa superior. </li><li> Tubería Harvest para el muestreo de la cultura. Instale este componente de altura ajustable en la placa superior. </li><li> Burbujeador de gas - reside en la parte inferior del recipiente y proporciona la infusión de gas a la cultura. Enganche rociador hasta la fuente de gas en el fermentador y montar en la placa superior. </li><li> Eje impulsor y el impulsor - el impulsor se mueve la cultura y es fundamental para mantener la uniformidad de la cultura en el vaso. </li><li> Condensador de gas de escape - para detener la pérdida por evaporación en el recipiente por enfriamiento de la ruta del gas de escape. </li><li> Líneas de la bomba de reactivos para el control de pH o adición de la alimentación. </li></ol></li><li> Limpiar el vaso y placa cabecera con agua y jabón. Se recomienda utilizar un cepillo suave para fregar el vaso y placa superior. Lejía o limpiadores con cloro no se pueden utilizar para limpiar el recipiente. </li><li> Si el material no está termolábiles, añadirlo al recipiente limpio. Sólo añadir hasta que se alcance el volumen máximo de trabajo. En este caso, el volumen máximo de trabajo es 3,3 L para un recipiente de 5 L de volumen total. </li><li> Monte la placa cabezal recipiente, asegurándose de que la junta tórica esté bien asentada. </li><li> Instale el condensador de gas de escape. </li><li> Instale la sonda antiespuma en su puerto 10 mm. </li><li> Instale el tubo de la cosecha en su puerto 10 mm. Ponga un pedazo de tubería en la parte superior de la misma y fijarlo apagado. </li><li> Instale la tubería y un filtro de 0,20 micras en la entrada de burbujeo y después fijar esto. </li><li> Calibre la sonda de pH: <ol><li> Reúna 2 tampones de referencia en pequeños vasos, una botella de lavado, y un wa repuestovaso de precipitados SH. </li><li> Enganche el pH de la sonda hasta el fermentador y gire el fermentador en. </li><li> Desplácese hasta el parámetro pH y utilizar el botón de menú, desplácese hasta la opción &#39;Cal&#39; y pulsar &#39;Enter&#39;. </li><li> Seleccione &#39;2 &#39;para 2 puntos de calibración. </li><li> Lavar la punta de la sonda y sumergir en el tampón de referencia baja. El valor en el fermentador se estabilizará. Usando la teclas + y -, ajuste el valor mostrado para que coincida con el valor de la memoria intermedia de referencia de pH. Una vez que deje de parpadear, pulse &quot;Enter&quot;. </li><li> Lave la sonda fuera y la inserta en el segundo tampón de referencia. Deje que el valor se estabilice y después utilice el teclado para que el valor que se muestra coincide con el valor de referencia alto amortiguamiento. Presione &#39;Enter&#39; para confirmar. </li><li> Lave la punta de la sonda y desconéctela del fermentador. Ponga la tapa protectora en la conexión e instalar en la placa superior. </li></ol></li><li> Abra la punta pO2 sonda y comprobar para asegurarse de que noes suficiente electrolito para cubrir la punta. Si no es así, añadir un poco al depósito y cerrar una copia de seguridad. </li><li> Instale la sonda de pO2 en la placa superior y asegúrese de que la tapa del autoclave se puso para proteger sus conexiones eléctricas. Se calibró después de la esterilización. </li><li> Obtener una botella de alimentación de reactivo con un tubo de inmersión y el filtro de aire. Añadir tubería de la bomba al puerto de tubo de inmersión y conecte el otro extremo al puerto de entrada en el fermentador. </li><li> Coloque la tubería en todos los puertos no utilizados luego pinza de la línea fuera. </li><li> Instale un filtro de 0,45 micras en el condensador de gases de escape. Este filtro se asegura de que el buque no presurizar en el autoclave. </li><li> Compruebe que todos los tubos que van por debajo del nivel de los medios de comunicación se sellan para evitar que el material salga a la luz. </li><li> Ponga el recipiente en el autoclave durante 25 - 30 min a 121 ° C, por ciclo de líquido. Precaución: Cuando sale va a ser muy caliente. </li><li> Instale el recipiente en la base del fermentador. </li><li> Conecte el pHsondear cable. </li><li> Conecte el cable de la sonda de pO2. </li><li> Enganche el rociador hasta el rotámetro adición de gas. </li><li> Añadir estérilmente 1 reactivo M NaOH a la botella con el tubo de inmersión e instale el cabezal de la bomba en la cabeza de la bomba de husillo base. </li><li> Coloque el sensor de temperatura en el tubo protector en la placa superior. Asegúrese de que va todo el camino a la parte inferior de la vaina. </li><li> Baje el brazo de agitación sobre el acoplamiento vasos impulsor. </li><li> Asegúrese de que el fermentador está encendido. </li><li> Verificar que el agua está disponible para el fermentador. </li><li> Encienda el suministro de aire al fermentador. </li><li> Desplácese hasta el parámetro de temperatura y ajustar la temperatura a 37 ° C. Pulse el botón &quot;Enter&quot; para iniciar el control de la temperatura. El recipiente se calienta en 15 minutos o menos. </li><li> Girar el flujo de gas a 1 volumen del recipiente de los medios de comunicación por minuto o menos. Para esta configuración, el flujo de gas es 3 L / min. Las burbujas deben aparecer en la parte inferior. </li><li> Desplácese hasta la agitación parameter y ajustado a 300 rpm. Presione &#39;Enter&#39; para activar la agitación. </li><li> Una vez que la temperatura ha llegado a 37 ° C, desplácese hasta el parámetro pH y ajustarlo a 6.8. Gire el control de pH pulsando el botón &#39;Enter&#39;. </li><li> Establezca la agitación a la velocidad máxima de 1000 rpm para la carrera. </li><li> Asegúrese de que la sonda de pO2 está polarizado correctamente para mostrar los valores adecuados. Después de 2 horas, desplácese al parámetro de PO 2 y utilice el botón &quot;Menú&quot; para seleccionar la &#39;Función Calibrar &quot;y seleccione la calibración de 1 punto. </li><li> Después de 15 minutos, utilizar los cursores para ajustar el valor a 100 y pulsa &#39;Enter&#39;. Esto calibrará PO 2. </li><li> Desplácese a la agitación y se puso a 300 rpm. </li><li> Con el botón &quot;Menú&quot;, gire el &#39;Cascade&#39; en &#39;on&#39; en el menú de la agitación. Esto aumentará la velocidad de agitación en un esfuerzo para despedazar las burbujas de aire y forzar más oxígeno en la solución a medida que aumenta la demanda de crecimiento. </li&gt; <li> Desplácese hasta el parámetro PO 2 y establezca el valor en 30. Pulse el botón &quot;Enter&quot; para iniciar PO 2. </li><li> Inicie el paquete de software de control de la PC. </li><li> Una vez que las sondas son calibradas, es estable agitación a 300 rpm, la temperatura es a 37 ° C y pH es cercano a 6,8, es el momento para inocular. El uso de alcohol, esterilice el puerto que se utilizará para la inoculación. </li><li> Dibuje el inóculo en una jeringa y añadirlo al puerto esterilizado. Cierre el puerto. </li><li> Marca el momento de la inoculación en un libro de registro. </li><li> También es importante tomar una muestra a tiempo de esterilización. Esterilizar el extremo del tubo de tubo de la cosecha con alcohol. </li><li> Abra la abrazadera que cubre el puerto de la cosecha y el uso de una jeringa para extraer una muestra. Esta primera muestra es generalmente descartado porque se ha sentado en la tubería. </li><li> Usar otra jeringa para extraer otra muestra. </li><li> Con un tercio de la jeringa, empuje el aire hacia atrás a través de la tubería para eliminar la mayor cantidad de volumen muertode la línea y la abrazadera de la línea de fuera. </li><li> Determinar la densidad de las células y el pH y registrar los valores. Con los cultivos microbianos, es útil para registrar los valores cada hora. Interval es dependiente de la cultura. </li><li> Metodología de cosecha depende de la intención para el cultivo después de que se complete el crecimiento. En este caso, muestra la cultura un tiempo final para recibir los valores de punto final para la densidad celular y la posible medición de pH o de peso celular húmedo. Abra la placa cabezal dispuesto de los contenidos en un &quot;tanque de matar&quot; designado con cloro u otros agentes antimicrobianos. </li></ol>

<ol>
	<li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).</li><li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing.">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li><li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor,+Monitoring,+Modeling+and+Simulation.">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li><li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1:+Identifying+a+Formulation.">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li><li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li><li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan,+a+bioengineered+heparin+precursor.">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Minifors operating Manual and user guide. , .</li></ol>

Autor A. Magno es un empleado de ATR Biotech que produce reactivos e instrumentos utilizados en este artículo.

Biorreactores de tanque agitado son el estándar en la industria de la biotecnología y se han utilizado durante más de 40 años 1. El tanque agitado pequeña ha sido importante para la ampliación, a escala reducida, la optimización de la tensión, la caracterización y desarrollo de procesos. También puede tener un papel importante en el desarrollo de la medicina individualizada 2. El biorreactor pequeña escala es más similar a las condiciones in situ para el crecimiento celular, ya que se puede supervisar y optimizado a lo largo de una carrera. Muy a menudo, los experimentos iniciales se realizaron utilizando matraces de agitación, pero las condiciones en el biorreactor pequeña escala difieren significativamente de la de frasco de agitación. En un experimento, se encontró que las condiciones para el crecimiento óptimo de los E. coli y la producción de la Proteína Fluorescente Verde (GFP) en el matraz de agitación no se traducen en el depósito de agitación (datos no publicados). Otros métodos de las células que crecen en gran escala incluyen botellas de rodillos, sencillo usí mecedora biorreactores plataforma 3 y biorreactores más grandes de un solo uso con un volumen de trabajo de 50 a 5000 L. Cada método proporciona desafíos para ampliación, pero ha encontrado un lugar en la producción. El uso único de oscilación biorreactor plataforma es similar a la de tanque agitado, y proporciona un entorno regulado. Se diferencia de la de tanque agitado en que la mezcla se produce debido a un movimiento de balanceo generar ondas para evitar la sedimentación de células y proporcionar la oxigenación. La hidrodinámica para este método son diferentes de la de tanque agitado y el volumen máximo está limitado a 1,000 L. Las diferencias pueden afectar el crecimiento celular y la producción de productos. Otros sistemas de un solo uso se combinan el depósito de agitación con el reactor desechable para, proporcionar una plataforma con un mínimo de infraestructura y sobrecarga asociada, y la capacidad de alto rendimiento bioprocesamiento 4. Los nuevos usuarios de biorreactores de sobremesa pueden tener problemas para determinar los puntos de ajuste iniciales de pH, pO 2 y temtemperatura, sin embargo, la investigación publicada se puede hacer referencia para esta información 5, 6, 7, 8, 9. Con cultivos bacterianos, en particular, se recomienda iniciar la agitación a la misma velocidad que el matraz agitador y la temperatura en el mismo punto de ajuste. Cultura de pH de matraces de agitación anteriores carreras también se puede utilizar como punto de partida. El ajuste del valor de pO2 es más difícil y se determina normalmente empíricamente. Sin embargo, a partir de 50% PO 2 es un punto de partida recomendado.

La tecnología de fermentación básica es una extensión de la técnica de matraz de agitación simple para crecimiento de cultivos. Se desarrolló a partir del deseo de controlar los entornos de crecimiento de cultivos vivos de una manera más completa y cuantitativa. Agitar frascos cultivo discontinuo se limitan generalmente a control impreciso de temperatura. La uniformidad de la temperatura en un agitador incubados o sala caliente es muy variable, a veces se desviaba 5 ° C o más desde el punto de ajuste deseado. Desde el matraz de agitación normalmente se agita a una velocidad fija, el intercambio de la absorción de oxígeno y de gas es limitada. Una vez que el oxígeno ambiental disponible se agota, la mayoría de las culturas no se desarrollan. No hay control del pH en matraces de agitación. En muchos casos, si la cultura no está limitado por prima de alimentación, se convierte en ácido hasta el punto de detrimento de la cultura y la respiración se ralentiza dramáticamente. La mayoría de agitar matraz culturas también se ejecutan como un «lote», lo que significa que se alimentan sólo una vez en o cerca del principio de las culturas inoculation. Después de que se consume esta fuente de carbono inicial, la cultura deja de crecer. En algunos casos, su metabolismo puede cambiar y empezar a consumir otros metabolitos en el caldo de cultivo, a veces cambiando las características de la biomasa resultante o proteína. Frascos de agitación también suelen estar sujetos a la pérdida por evaporación de comunicación en ambientes de cultivo de verano, por lo general el 10% del volumen por 24 horas a 37 ° C. Esta pérdida cambia la densidad del cultivo y se prohíbe el funcionamiento a largo plazo del sistema. Finalmente, el usuario puede encontrar la formación de espuma de los medios de comunicación después de la agitación. La aparición de espuma en el espacio de cabeza por encima de la cultura limitará el intercambio de gases y un mayor crecimiento de la babilla. El sistema de fermentación básica está diseñado para hacer frente a todas estas limitaciones. El control cuidadoso de la temperatura se consigue en recipientes de fermentación por el uso de la agitación del impulsor y una camisa de calentamiento. Un sensor insertado en el recipiente y la retroalimentación de control de la calefacción y refrigeración de esta chaqueta generalmenteresultados en el control de temperatura de ± 0,1 ° C en torno a la consigna. Fermentadores de sobremesa generalmente proporcionan un control de pH mediante la adición de reactivo líquido a través de una bomba. El valor de pH se controla continuamente en un esfuerzo para mantener el óptimo entorno para el crecimiento celular. La correcta aireación se mantiene por el impulsor de mezcla antes mencionada o por la infusión de aire o gas de oxígeno suplementado directamente en la cultura. Con los cultivos sensibles al cizallamiento, el gas oxígeno complementado es el principal mecanismo para el mantenimiento del nivel de oxígeno en la cultura. La medición de oxígeno en solución se consigue normalmente por una sonda polarográfica que normalmente no está disponible para su uso en matraces de agitación. También es posible añadir de forma continua o periódicamente de alimentación al recipiente para mantener el crecimiento de una forma lineal o exponencial. El condensador de gas de salida proporciona una superficie fría para el vapor en el flujo de gas de escape para condensar, preservando así volumen de cultivo y la densidad. Además periódica de surfactante antiespumante es accionadapor una sonda de conductividad en la cultura, la reducción de la espuma en la superficie y permitiendo el intercambio de gases. El buque, con todas las sondas, los accesorios, los impulsores, tuberías de recolección, y los tubos, se monta y se esteriliza en una autoclave estándar. Después de calibraciones sonda definitiva y la estabilización de entorno operativo, se añade la cultura de la embarcación. El sistema puede entonces ser utilizado para caracterizar la cultura de una manera que es más cuantitativa y precisa que con un método de frasco de agitación. El control estricto de la temperatura, pH, contenido de oxígeno, consumo de alimento, la evaporación de líquido, y niveles de espuma, todo ello contribuye a una mucho mayor biomasa y mejor rendimiento de proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="356">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">ampicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A1593-25G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">antifoam 204</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A8311</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1 M Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>38215-1EA-R</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 4.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B5020</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 7.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B4770</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">pO2 probe electrolyte</td>
			<td style="width:117px;">Broadley James</td>
			<td>AS-3140-C30-0025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.45 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-02915-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.22 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-29950-40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Luer Lock syringe, 10 mL</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-07940-12</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Minifors Bioreactor</td>
			<td style="width:117px;">Infors HT</td>
			<td style="width:117px;">B-Pack 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Air Admiral air pump</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-79202-00</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1175 PD Chilling circulator</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td style="width:117px;">13721-204</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

operation of a benchtop bioreactor

Sistemas de fermentación se utilizan para proporcionar un entorno de crecimiento óptimo para muchos tipos diferentes de cultivos de células. La capacidad ofrecida por fermentadores para controlar cuidadosamente la temperatura, el pH y las concentraciones de oxígeno disuelto en particular, los hace esencial para el crecimiento a gran escala eficiente y la expresión de productos de fermentación. Este video describe brevemente las ventajas del fermentador en el frasco de agitación. También identificará los componentes clave de un sistema típico de la fermentación de sobremesa y dar instrucción básica sobre la configuración de la embarcación y la calibración de sus sondas. El espectador se familiariza con el proceso de esterilización y se muestra cómo inocular el medio de cultivo en el recipiente con la cultura. También se mostraron los conceptos básicos de manejo, muestreo, y la cosecha. También se debatirá sobre el análisis de datos simple y limpieza del sistema.

El biorreactor se puede ejecutar con o sin el software IRIS. Sin embargo, para la captura de datos, lo mejor es utilizar el software. Antes de la adición de las bacterias, los sensores de pH y oxígeno deben ser calibrados, el ajuste de la velocidad del impulsor y el ajuste de la temperatura. En la Figura 2, se presenta la salida de datos para un funcionamiento biorreactor. La temperatura se fijó a 30 ° C, la velocidad del impulsor a 200 rpm. Los parámetros pueden ser diferentes para cada experimento, pero antes de la adición de las bacterias, el sistema debe ser en estado de equilibrio. En la Figura 3, se muestra el cambio en la concentración de oxígeno con la adición del cultivo bacteriano. Los puntos de ajuste para este experimento son de 37 ° C, un agitador a 200 rpm, O 2 al 70%. A la hora 19:20, la bomba de alimentación proporciona el cultivo de siembra bacteriana a una DO de 0,1 provocando una caída inmediata en el nivel de O 2. El biorreactor responde a la cambiar el nivel de O 2 con un aumento en la velocidad de flujo de aire y el impulsor. Tél puso los puntos sobre los aumentos se establecen en la cascada (paso 35). El pH del reactor se controló en tiempo real, con el pH disminuyendo luego aumentando como se demuestra por la fluctuación de la línea de pH con el tiempo (Figura 4). Todo el funcionamiento se puede analizar y ajustar los parámetros para los experimentos posteriores. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> Figura 1. Biorreactor de bancos de trabajo con todas las partes marcadas y conectados. Esta figura muestra el reactor de tanque agitado en el comienzo de una carrera. Las partes del reactor se etiquetan y se incluyen los sensores, impulsor, indicador de temperatura, botellas de alimentación y toma de muestras, la lumbrera de escape, manómetro, camisa de calentamiento, torre del condensador, y el panel de control. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> Figura 2. La imagen en pantalla de sof biorreactortware al comienzo de la carrera. Al inicio de una carrera de tanque agitado, la temperatura se ajustó a 30 ° C (línea amarilla), la velocidad del rotor a 200 rpm (línea roja), pH 6,5 (línea verde), y PO 2 al 57,2% (línea azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> Figura 3. La imagen en pantalla del software biorreactor durante la carrera como el oxígeno disminuye. Cuando el cultivo está en fase de crecimiento activo, consume oxígeno y la cantidad de oxígeno en el reactor se redujo (línea azul). Al aumentar la velocidad del impulsor, más oxígeno se puede agregar a la cultura (línea roja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . Figura 4. La imagen en pantalla del software de biorreactor que muestra el cambio de pH en el tiempo. El pH del cultivo se controla de forma continua y con el tiempo se disminuye a medida que se produce ácido láctico y luego aumenta a medida que la base se añade al biorreactor (línea azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> .

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Operation of a Benchtop Bioreactor

Los fermentadores se utilizan para aumentar el rendimiento de la cultura y la productividad de las células obtenidas por biotecnología. Después de revisar varios microbios o animales candidatos de cultivo de células en matraces de agitación, el siguiente paso lógico es incrementar la biomasa del cultivo seleccionado con el fermentador. Este video muestra la configuración y el funcionamiento de un sistema típico de biorreactor de sobremesa.

La operación de un biorreactor de sobremesa

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

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JoVE Journal

Bioengineering

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Video: Operation of a Benchtop Bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

La ingeniería biológica basada en los injertos vasculares El uso de un biorreactor pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construcción y caracterización de un Fold biorreactor Novela Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

El cultivo de células de mamífero utilizando un solo uso Sistema Neumático biorreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Un biorreactor Novela de alta densidad de cultivo de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This paper presents a cleanroom "light" fabrication process of carbon fiber neural electrode arrays that can be learned quickly by an inexperienced cleanroom user. This carbon fiber electrode array fabrication process requires just one cleanroom tool, a Parylene C deposition machine, that can be learned quickly or outsourced to a commercial processing facility at marginal cost. This fabrication process also includes hand-populating printed circuit boards, insulation, and tip optimization. 
The three different tip optimizations explored here (Nd:YAG laser, blowtorch, and UV laser) result in a range of tip geometries and 1 kHz impedances, with blowtorched fibers resulting in the lowest impedance. While previous experiments have proven laser and blowtorch electrode efficacy, this paper also shows that UV laser-cut fibers can record neural signals in vivo. Existing carbon fiber arrays either do not have individuated electrodes in favor of bundles or require cleanroom fabricated guides for population and insulation. The proposed arrays use only tools that can be used at a benchtop for fiber population. This carbon fiber electrode array fabrication process allows for quick customization of bulk array fabrication at a reduced price compared to commercially available probes.

Here, we describe fabrication methodology for customizable carbon fiber electrode arrays for recording in vivo in nerve and brain.

Kit de herramientas de código abierto: Matriz de microelectrodos de fibra de carbono de sobremesa para grabación nerviosa

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

Biorreactor guiado por imágenes para generar tejido biodiseñado de las vías respiratorias

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...