GEM由来の膠芽腫細胞を免疫適格マウス脳に頭蓋内注射し、ヒト膠芽腫の重要な特徴を再現する腫瘍を作成するための最適な技術について説明します。GEM由来TRP細胞の同所性注入のためのこの技術は、皮質に由来する腫瘍に対して再現性が高く、スケーラブルで一貫した結果をもたらしますが、GEM腫瘍の浸潤性を維持します。マウス膠芽腫脳腫瘍は積極的な増殖を示し、周囲の脳実質に浸潤します。
したがって、患者の腫瘍浸潤および遊走を抑制する可能性のある治療法を評価するために使用することができる。このプロトコルは、他の脳腫瘍モデル、ウイルス、治療薬用にカスタマイズすることも、定位固定装置座標の調整により異なる脳領域への注射に適合させることもできます。手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるデボン・アトキンソンです。
はじめに、固定装置の下と作業面に表面プロテクターを置きます。麻酔器からのビニールチューブを脳定位固定装置のガス麻酔プラットフォームのインポートに接続し、別のチューブをそのアウトポートに接続します。デジタルディスプレイを電源と装置に接続します。
次に、マイクロポンプコントローラを電源に接続した後、装置のマニピュレータアームにマイクロポンプを取り付ける。マイクロポンプを毎秒5.6ナノリットルに設定します。マウスの加熱パッドを温度コントローラーと電源に接続します。
気泡を避けて、メチルメチルセルロース細胞混合物を含む30ゲージ精密シリンジをバックロードします。プランジャーを挿入した後、針を取り付け、装填されたセル混合物が針を通って落ちるまでプランジャーを押し下げます。70%アルコール調製パッドで針をきれいにします。
精密シリンジをマイクロポンプに取り付けたら、マウスを置く前にマニピュレーターアームをステージから離して回転させ、シリンジの針がずれないようにします。麻酔をかけたマウスを固定装置に移し、上歯をノーズコーンサポートに置いてノーズコーンに固定します。ノーズコーンをノブで締めた後、つま先をつまんで反射神経を確認し、適切な麻酔を確認します。
次に、イヤーバーを挿入し、ノブを締めて頭を固定します。麻酔条件下で眼軟膏を塗布して眼を滑らかにする。ブプレノルフィンSR鎮痛薬を皮下注射し、直腸マウスプローブを配置して内部温度を監視します。
外向きの円を使用して、外科用スクラブとエタノールを3回交互に使用して手術野を滅菌します。ピンと張った皮膚を鉗子で引っ張り、メスの刃を使って目の間に長さ約1センチの切開を入れます。細胞注入の場合は、シリンジをマウスに取り付けた状態でマニピュレーターアームを戻します。
ノブを締めた後、水平面のXノブとYノブを使用してシリンジを動かし、ブレグマに取り付けます。Zノブを使用して針を下げてブレグマの位置を確認し、デジタル読み出しコンソールをゼロに設定します。次に、原稿に記載されているように、XノブとYノブ、および対応するデジタル読み出しを使用して針を目的の位置に移動し、Zノブを使用して針を頭蓋骨の表面に移動します。
25ゲージの針が取り付けられた1ミリリットルの注射器を使用して頭蓋骨に穴を開けます。針のベベルを30ゲージの精密シリンジに向けて置きながら、マニピュレータアームを慎重に横に回転させます。精密シリンジ針を装填したマニピュレーターアームを穴の上に配置したら、針先を穴に合わせ、Zノブを使用して針を脳の硬膜に下げます。
デジタル読み出しコンソールをゼロに設定した後、Zノブで針を1ミリ下げ、1分間待ちます。2ミリメートルの深さに達したら、マイクロポンプを停止し、2マイクロリットルの細胞懸濁液が注入されたときにポンプが停止することを確認します。頭蓋骨から針を外すには、針を1ミリメートル上げて1分間待ちます。
創傷閉鎖のために、綿の先端のアプリケーターの木の端を使用して、骨ワックスの部分を取り、それを円錐形に形作ります。ワックスを頭蓋骨の開口部に入れた後、穴に押し込みます。ビーズ滅菌鉗子を使用して、頭蓋骨に残っているワックスを溶かします。
滑らかになったら、麻酔薬ブピバカイン溶液を2滴切開部に加え、鉗子を使用して皮膚の端を一緒に引っ張ります。1つまたは2つの巻き取りクリップを使用して皮膚をぴんと張った後、皮膚を閉じ、ドラフトのない領域の加熱パッド上の清潔な回復ケージにマウスを置き、マウスを注意深く観察します。毎週のMRIスキャンでは、脳内の腫瘍量の増加と腫瘍体積の測定が示されました。
MRI腫瘍体積測定では、放射線治療後も腫瘍増殖抑制の欠如が認められ、投与マウスの生存率は上昇しなかった。同系モデルのGBM腫瘍は積極的に増殖し、終末端で頭蓋骨を破ったように見えた。細胞移植後の画像検査で頭蓋外増殖が認められる場合は、注入過程における細胞漏出を示しており、注射針の抜去時にはさらに注意が必要である。
同所性TRP GBM腫瘍の病理組織学的検査では、偽パリサードや壊死などの腫瘍の特徴的な特徴の再現を含む、グレード4の星状細胞腫の存在が確認されました。ブレグマにゼロ点を設定するときは、正しい細胞注入座標を確保するために正確にしてください。外傷や逆流を防ぐために、脳内の針を上下させることは遅くなければなりません。
腫瘍細胞の注入後、毎週のMRIスキャンを使用して、治療を開始する前にベースラインの腫瘍サイズを決定し、脳内の変化する腫瘍量を視覚化できます。
