The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1.フライラインの生成<ol><li> 2異なる構築物を生成します。最初の構築物では、RpL10AのcDNA（リボソームタンパク質サブユニットL10A）はpUASP-PL-GFP-NTERプラスミド（32から修正版）にGFPの下流にクローニングされます。生殖細胞系列のプロモーターの使用は、トランスジェニックラインのより多くの多価利用することができます。 注：pPTGAL4プラスミドを使用して、GAL4（TF）の上流に前かがみ遺伝子の組織特異的発現を駆動する調節配列をクローニングすることにより、第2の構造体を取得します。 </li><li> （標準的な手順に従って）33 ワット1118ハエに別々のプラスミドを注入し、Pエレメントの挿入によってハエのゲノムに構築物を挿入します。 </li><li>二つの異なる染色体上の構築物でフライラインを回復するために、形質転換体を選択します。最終TRAPラインは一つの二重トランスジェニック安定ラインを得るために以下の2行（遺伝的交雑）を組み合わせて作成されます。 F0：W-。 CYO、UAS EGFP :: RpL10A。 MKRS / TM6BX W-; CYO / SCU;前かがみGAL4 / TM6B。 F1：W-。 CYO、UAS EGFP :: RpL10A。前かがみGAL4 / TM6B。超この行を増幅し、所望のステージの胚を収集します。 </li></ol> 2.胚コレクション<ol><li> （18万ハエ/ケージの周り）ケージあたり若いハエの約40グラムを含む8大型円筒人口ケージを準備します。 </li><li>そうハエが彼らの卵管から胚を開発クリアすることができ、その前産むと呼ばれるに進みます。そのため、固化した寒天とグレープジュースの混合物を含有する2 11センチメートル径のペトリ皿に1時間ハエを置き、新​​たに作られた酵母ペーストで表面の⅓をカバーしています。 3後グレープジュースプレートの交換は同様のたてプレート上の実胚を収集します。 注：インキュベーション時間は研究発達時間窓に応じて異なります。 </li><li>ケージからプレートを取り外して、正しい発達段階を得るために必要な時間同温度でそれらを残す（例えば、ADDITの産卵+ 10時間の3時間ionalのインキュベーションは、10〜13時間の産卵（AEL））後の段階から胚を提供します。ブラシを使用して50mlの水でプレート内容（胚、酵母ペースト、死んだハエ）を再懸濁します。 </li><li>死んだハエの胚および残りの体の部分を分離し、小径ふるい上に残った胚を収集し、次いで脱イオン水で簡単に洗浄するための篩（700ミクロン、355ミクロン、112ミクロン）のシリーズを通過します。それはふるいを詰まらせることができますようにコレクションごとに18以上のプレートを使用しないでください。 </li><li> 2分間の脱イオン水中の4.5％の漂白剤でDechorionate胚および30〜60秒間、脱イオン水で十分に洗い流してください。攪拌しながら室温で5〜10分間、PBS、0.01％トゥイーン20、100μg/ mlのシクロヘキシミドで胚を培養します。 </li><li>セルロース吸収性シートの乾燥胚およびマイクロ遠心チューブに移します。チューブの重量を測定し、液体窒素に浸漬することによって胚をフラッシュ凍結。この段階では、乾燥した胚を、-80℃で数ヶ月間保存することができます。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。 GFP抗体に結合された磁気ビーズの調製<ol><li>徹底的に穏やかに撹拌して、元の瓶の中にプロテインG磁気ビーズを再懸濁します。 </li><li>転送90 RNaseフリーのチューブにビーズμlのマグネット（30〜60秒）でそれらを収集。ビーズ90μlを60〜80 mg / mlのタンパク質を含む溶解物1mlの免疫沈降（IP）を行う必要があります。ビーズの飽和を防止するための比率を尊重。タンパク質の量に応じて、いくつかのチューブを使用してください。 </li><li> 1×PBS、0.01％トゥイーン20（500μL）でビーズを洗浄し、上清を廃棄し、磁石にビーズを収集します。ビーズに0.01％のTween 20のPBS 350μlのGFP抗体30μgのを追加し、室温で30分間混合端の上にゆっくりと端とインキュベートします。 </li><li> 、磁石（30〜60秒）にビーズを集め、上清を破棄し、ポリソーム抽出緩衝液500μlですすぐ（ヘペス10mMの、のKCl 150 mMの、のMgCl 2 5mMの、DTT、0.5mMの、トリトン1％、シクロヘキシミド100μg/ mlの広報otease 1×阻害剤、RNaseインヒビター100 U）。 </li><li>磁石にビーズを収集し、バッファ（BSA 0.1μgの/μL、酵母tRNAは0.1μg/μL、ポリソーム抽出緩衝液中のグリコーゲンは0.1μg/μl）をブロックする500μlを添加します。 </li><li>室温で30分間インキュベートし、新鮮なブロッキング緩衝液で1回、この手順を繰り返します。 </li><li>その後、ビーズを思い出すと免疫精製ステップ（セクション6）にすぐに進み、磁石にビーズを収集し、ポリソーム抽出緩衝液500μlですすぎます。 </li></ol> 4.溶解物の準備<ol><li>開始する前に、多方向高速ビーズグラインダーのプログラムを設定：2×10秒間5000rpmで、15秒のポーズで。ポリソーム抽出バッファーを含む氷の上に予備冷却15ミ​​リリットルチューブに乾燥させた胚（1.5 g）を移し、すぐにホモジナイズします。ポリソーム抽出緩衝液4ml中の胚を1.5gを均一化。 </li><li> 2で均質化された胚を広げ2 mLの試験管を予冷し、エンブリーを挽きますホモジナイザープログラムを実行して、OS。氷の上に新鮮な予冷マイクロ遠心チューブにライセートを移し、2000グラムで10分間、4℃で遠心分離して核後上清を準備します。 </li><li>氷の上に新鮮な予冷マイクロ遠心チューブに上清を移し、上澄み液（最終濃度= 0.1％）に10％のNonidet P-40の1/100サンプル容量を追加し、チューブを反転させて軽く混ぜます。 </li><li> 300mMの1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DHPC）（最終濃度= 30mmの1/9サンプルボリュームを追加、チューブの底に液体を収集するためのパルス遠心minifugeのサンプル）、（インキュベーションの間に数回転倒混和）チューブを反転させて静かに混合し、氷上で5分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 20,000gで10分間4℃で遠心分離することにより、ポストミトコンドリア上清を準備します。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定します：溶解液中の濃度は60〜80 mg / mlの間であるべきです。 T新鮮な新しい予冷マイクロチューブに上清AKEと前吸収工程（第5節）にすぐに進みます。 </li></ol> 5.前の吸収<ol><li>徹底的に穏やかに撹拌して磁気ビーズを再懸濁し、室温でマイクロ遠心チューブに（ビーズ/ 1ミリリットル胚溶解物の30μl）をビーズ30μlのを転送します。 </li><li> 、磁石のビーズを集め上清オフピペット、およびポリソーム抽出バッファー（500μlの）中でビーズを再懸濁します。 、磁石上にビーズを収集し、胚溶解液を追加し、回転装置上で4℃で1時間インキュベートします。 <ol><li>ビーズを除去し、免疫精製工程のために氷上で上澄みを保ちます。免疫精製前に、例えば、RT-qPCRにより、免疫精製後に回収したRNAサンプルとグローバルなRNAサンプルを比較するために、上清（入力）の100μLを保ちます。 </li></ol></li></ol> 6.免疫精製<ol><li> 1ミリリットル（60〜80 mg / mlのタンパク質に対応する）のを加えますGFP抗体に結合されたブロックされたビーズの90μLを含むRNaseフリーのチューブに、溶解物を事前に吸収しました。チューブ回転で穏やか転倒混合しながら2時間、4℃でサンプルをインキュベートします。また、4℃でのインキュベーションのO / Nを実行します。 </li><li>インキュベーション後、磁石にビーズを収集します。その後、0.5 mMの、シクロヘキシミド100μg/ mlのRNアーゼ阻害剤100 U洗浄緩衝液500μl（ヘペス10mMの、KClの350ミリメートル、のMgCl 2 5mMの、ノニデットP-40 1％、DTTで再懸濁し、ビーズをスピンダウンするminifugeを使用して、 ）と磁石の上にそれらを収集。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>新しい予冷RNaseフリーのチューブにビーズを変更し、二回洗います。磁石にビーズを収集し、ビーズに直接1ミリリットルのTRIzolを追加することにより、RNA抽出に進み、製造元の指示に従ってください。 </li></ol> 7. RNAのクリーンアップと品質評価<ol><li>製造業者の指示に従ってのRNeasyマイクロキットを使用してください。完了時に、ELUT（x）のμlのRNaseフリー水を用いて電子のRNA。 2 60℃分、-80℃で保存スナップ凍結サンプルのために暖かいです。バイオアナライザーを用いてRNAの品質をチェックします（製造元の指示に従ってください）​​。 </li><li> TRAPed RNAの特異性をテストするために、製造業者の説明書（上付き文字III）に記載の精製されたRNA（入力およびIP）の3 ngの上で逆転写反応を行います。遺伝子特異的プライマーセットを用いて、定量PCRのために得られたcDNAを使用してください。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、ショウジョウバエの胚では珍しい細胞集団の研究に専念修正翻訳リボソームのアフィニティー精製プロトコル（吹き替え「TRAP-RC &#39;）を記述します。情報は、胚の溶解およびポリソーム抽出のためのマイクロアレイまたはRNA-seqの分析、 すなわち 、1）必要な生物学的物質の量と最適化された手順に適した収率で特定のRNAの正常な分離のための重要なステップに設けられています。最適な免疫沈降のための2）ビーズ/抗体への溶解物の比率; 3）高い特異性および感度を有するTRAP-RC実験を実行するように、洗浄緩衝液組成を含むバックグラウンドの低減を可能にするステップ。 このプロトコルは、容易に任意の他の細胞型に適用作る再現可能なデータが得られます。この技術は、積極的に、mRNAの翻訳レベルで遺伝子発現差を分析し、従ってスペックでタンパク質の発現を理解する道を開くことを可能にします<html>特定の時間窓でのIFICセルタイプ。タンパク質存在量が翻訳及び分解プロセスの速度に依存することに注意してください。 TRAP法の主な制限は、正確な定量的にタンパク質含有量を測定するための、または翻訳後修飾を検出することができないことです。 mRNAの本体に沿ってリボソーム密度を測定し、そうすることで、細胞型特異的に非常に強力なツールをフットプリントリボソームと結合したTRAPを作ることができることにより、定量化を改善します。最近の論文34において、この組み合わせは、ヒト胚性腎臓293細胞で行いました。著者らは、ストレプトアビジンビーズを使用してRpL10Aの誘導ビオチン化形態の親和性精製したヌクレアーゼフットプリントを実行しました。これは、制限を目的とするために必要な生物学的物質の量であり、特定の細胞型を標的にしながら、生物全体にリボソームフットプリントを行うことが可能であるという原理の証明です。 &quot;&gt;グローバルトランスクリプトーム解析と並行してTRAP実験を行うことにより、新たに転写の間の割合を追跡することを可能にし、RNAを翻訳actively-。これは、特定の発達の状況や特定の細胞集団で行われる潜在的な転写後のメカニズム深く有益になります例えば-byマイクロRNA。 結論として、TRAPは、細胞特異的に能動的に翻訳するリボソームに結合したRNAを識別するための非常に効率的で特異的かつ高感度な方法です。この方法は、生物および組織型の多種多様に使用することができます。ここで説明する新しいTRAP-RCプロトコルは希少細胞集団（総細胞数の1％未満）および全ゲノムレベルでのその後の分析のために十分な最終材料の量のために最適化しました。 この方法の可能な制限は、コンプするのに十分な量のタグ付きリボソームを製造するための強力なドライバの必要条件であります標的細胞型における内因性タグなしのものとETE。最近の研究25では 、著者は10〜30％にタグなしリボソームに対するタグ付けの割合を推定しました。 UAS-RpL10A-EGFPのコピー数を増加させるこの問題を克服するためには、かなりこのバランスを改善するはずです。あるいは、記載の遺伝的バックグラウンドにUAS-GAL4導入遺伝子を追加するGAL4タンパク質の産生を増幅し、間接的にRpL10A-EGFPの発現を増加させます。これは、mRNA上のタグ付けされたリボソームのよりよい占有を優先すべきです。 このすでに効率的なアプローチは、より強力な、より定量的な側面を持ってたり発見し、遺伝子発現の制御のために必須である分子機構を解明するために補完的な方法を適合させることにより行うことができることに注意してください。

細胞は、開発中に特定のプロパティを取得する方法を理解することは、臓器の複雑さと病理学的状態に対するそれらの潜在的な進化を理解するために非常に重要です。 unrevealing全体的な遺伝子発現プロファイルによってセルの仕様と分化を根底遺伝子調節ネットワークを解読するための大きな研究プッシュがあり、ポルII結合状態、調節配列またはヒストンの翻訳後修飾の転写因子占有。 グローバルレベルマイクロアレイでの遺伝子発現を評価し、RNA-seqのアプローチが使用されています。マイクロアレイは、RNA-seqは、コードを含むとマイクロRNA、lncRNAsかのsnRNAのような非コードRNAのRNAの異なる種類の通知に良いギヤードであるのに対し、mRNA量を検出することを可能にします。しかしながら、これらの技術は、活発に転写、定常状態のmRNAを区別能動的mRNAの翻訳、そしてmRNAが分解プロセスに入ることができません。着実-STの測定mRNAレベルは、プロテオーム組成1-3の悪い推定であることが知られている食べました。逆に、積極的に、翻訳のmRNAを同定することはタンパク質生産のより正確な画像を提供します。 しかし、トランスクリプトーム研究は主に解釈が困難な遺伝子発現プロファイルを作成する、野生型条件4-7または解剖組織上の特定の因子の機能の損益を比較することにより、全生物レベルでつながってきました。細胞標的ツール、アフィニティ精製および感度の改善​​の最近の進歩は、現在ゲノムワイドな生体内の小さな細胞集団または単一の細胞に分析を行うことができます。 ショウジョウバエでは、トランスジェニック系統の大規模なコレクションは、細胞機能のために必要な分子機構のより正確な定量化をもたらすGAL4 / UASシステム8-10を経由して異なる組織および細胞亜集団の特定の時間的、空間的ターゲティングを可能にします。 11をキャプチャする方法として説明しました。ショ糖勾配遠心分離に基づいて、この方法は、マイクロアレイまたは深いシーケンシングで分析すると、mRNAのポリソーム画分と決意の選択はゲノムワイドな翻訳ができます。ポリソーム分離は、翻訳プロセス12の間にリボソームによって保護されたRNA断片に対応するリボソームフットプリントを識別するために、ヌクレアーゼ消化と結合することができます。リボソームフットプリントは、RNAの翻訳およびRNA配列レベルの解像度およびリボソーム位置決めの定量化の精度を増加させる、翻訳の速度を測定することができます。しかし、今日まで、それは、主としてリボソームフットプリンティングプロセスの最後に得られたRNAの収量の強い減少に、translatomesの細胞特異的単離に適用されていません。 RNAのサイズ選択は、潜在的な偽Pを生成することができることを考えるとまた、同様にRNAを保護することができ、異なるのRNPからositivesは、さらなる開発がリボソームフットプリントを改善し、細胞特異的なアプローチに適合させるために必要とされます。 このような方法の一つは、翻訳リボソーム親和性精製（TRAP）は、ハイマンらによって 2008年に記載されていると呼ばれます。マウスのニューロンのサブセットからtranslatomeを単離するために適用されます。エピトープタグ付け細胞型特異的にリボソームタンパク質をすることによって、ポリソームを選択的細胞解離および選別の手間のかかる工程を経ずに精製することができます。この場合は、リボソームの表面の60Sリボソームタンパク質L10Aは、eGFPを13でタグ付けされました。 2008年以降、いくつかの研究は、Xに 14〜19匹のマウスから、異なる種でこのメソッドを使用しています24シロイヌナズナ20,21、ゼブラフィッシュ22,23とシロイヌナズナをアフリカツメガエル 。 TRAP方法は、 ショウジョウバエモデルに適合し、プリするために使用されています神経細胞25とアストロサイト26からFY細胞型特異的mRNA。多目的バイナリGAL4 / UASシステムは、組織特異的にGFPタグ付きRpL10Aを発現するために使用しました。大人のハエの頭を配列決定した（汎神経ELAV-Gal4ドライバーによってターゲット）神経細胞および単離したRNAからポリソーム選択を実行するために解剖しました。アップレギュレートされる遺伝子の多数は、 ショウジョウバエの胚の開発に（1未満の細胞の％）現在のアプローチは、優れた特異性を有することを示す、希少細胞集団に適合させるために、私たちを促し、神経系で発現することが知られているものに相当します。 分子俳優や形態形成の動きが進化的に保存されているようショウジョウバエモデルの中では、胚段階では、発達過程の研究のための選択のモデルです。このモデルでは、これまで行っのみ組織特異的トランスクリプトームアプローチはそう細胞または核を使用して行われてきましたrtingだけハエ胚の組織/細胞特異的translatomeプロファイリング専用の方法の必要性を作成し、定常状態のトランスクリプトーム27-31を研究することができました。ここでは、 ショウジョウバエの胚に捧げ最初のトラッププロトコルを報告しています。この方法では、胚当たり約100筋細胞の非常に制限された細胞集団における従事イン翻訳mRNAは、正常に高品質と特異性で単離しました。以前に25示すように、バイナリGAL4 / UASシステムは、明らかな表現型や発育遅延、任意の毒性を伴わずに筋肉の部分集団におけるGFPタグ付きRpL10Aの発現を駆動するために使用されていません。 ショウジョウバエの胚は筋肉組織に上昇を与えるhemisegmentあたり30筋肉を持っています幼虫の。前かがみのアイデンティティ遺伝子の近くで発見された調節領域を使用することにより、30多核筋のうち6が対象としています。このアッセイでは、リボソームが翻訳伸長を使用して、mRNAの上に固定化しますシクロヘキシミドを阻害。サイトゾル抽出物は、その後、GFP抗体でコートした磁気ビーズを用いてアフィニティー精製のために使用されます。精製したRNAの品質は、バイオアナライザーを使用して検証しました。定量的逆転写PCR（RT-qPCRには）mRNA単離の特異性および感度を決定するために使用され、我々の最適化プロトコルは非常に効率的であることが実証されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

ショウジョウバエの胚の体細胞の筋システムがhemisegmentあたり30の筋肉で構成され、各筋肉は、プロパティの特定のセットを持っています。アイデンティティ遺伝子、位置、融合イベント、付着部位と神経支配の数のコード。特定の筋肉のサブセットに翻訳されたmRNAを同定することは、これらの特定の筋肉の特性を形成するために必要なタンパク質の情報を提供します。 TRAPベースの方法を使用して、同一遺伝子前かがみを発現する筋肉の亜集団からのRNAは、（ 図1A-B）で精製しました。このアプローチの主要な関心事は、単離されたRNAの品質と特異性です。ここで報告された最適化されたプロトコルは、バイオアナライザー分析を用いて評価した高品質のRNAの体系的な回復を可能にしました。得られたプロファイルは、RNA（ 図1C）の劣化を示さありません。 トラップ法を中心に開発された他の研究では、質問は、データの特異性を調達しました。ここで私はビーズまたはチューブにRNAの非特異的結合および洗浄緩衝液の最適化によって結合されたバックグラウンドを抑制するための方法をmprove。前かがみ発現細胞を単離するバックグラウンドレベルと効率を評価するために、我々は同じ胚段階の3反復のRT-qPCRの試験を主導しました。 4つの異なる遺伝子の-富化をフォールド（MEF2、前かがみ、プロスペロー、soxNeuro）はRpL32遺伝子（ 図1D）に対する入力と正規化と比較して算出しました。これらの結果は、汎筋肉遺伝子MEF2と前かがみ遺伝子の5.6倍の濃縮の2.3倍の濃縮を示しました。対照的に、神経系で表される2つの遺伝子が枯渇入力と比較しました。非常に類似した倍数変化値は、プロトコルが堅牢であることを実証し、3生物学的反復に観察されました。 150×10 ^ 6の正の（合計100 GFP細胞/胚を含んで得られた1.5×10 ^ 6胚を中心に、1.5グラムで始まる前かがみ-Gal4ドライバーを持つと細胞）。 TRAP実験を実行した後、収量は、ステージ・オブ・関心に応じて、特定のRNAの約25〜45 ngのです。この材料は、マイクロアレイ解析またはRNA-seqのライブラリーを構築するために増幅プロトコルを用いてRNA-seqのを実行するのに十分です。効率がRpL10A-EGFPを発現するために使用されるドライバの強さに強く依存します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> 図1.品質と前かがみ-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP胚からのTRAP-単離されたRNAの特異性評価。 （AB）hemisegment（A）ごとに6つの前かがみの筋肉細胞に特異的にRpL10A-EGFP発現を示すステージ16胚の共焦点画像。一般的な筋肉のマーカーBeta3tubulinとRpL10A-EGFPの共局在は、マージ画像（B）に観察されます。 （C）TRAPed RNA raの品質管理nはバイオアナライザー上のrRNA 18Sおよび28Sの完璧な整合性を示します。 （D）ステージ16胚の3生物学的複製のTRAP-単離されたmRNA実験の高い特異性を示す、RT-qPCR分析。倍の変化は、入力とRpL32遺伝子に対して正規に比べて計算されます。すべての筋肉系統に存在するMEF2転写物は、より制限された前かがみの転写物が5.6倍に富むあるのに対し、入力に比べて2.3倍に富むです。 プロスペローとsoxN遺伝子を発現する神経細胞が2.2倍に枯渇し、それぞれ5.5倍されています。エラーバーは標準偏差を表す（n = 3）であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K ビュー.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

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Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

生物学

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

ショウジョウバエの胚の生体内の遠心

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

の直立イメージングショウジョウバエ胚

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

リビングでのイメージング、細胞の形状の変更ショウジョウバエ胚

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

転写産物および代謝物からの精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ヘッド

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...