Name: trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1.フライラインの生成<ol><li> 2異なる構築物を生成します。最初の構築物では、RpL10AのcDNA（リボソームタンパク質サブユニットL10A）はpUASP-PL-GFP-NTERプラスミド（32から修正版）にGFPの下流にクローニングされます。生殖細胞系列のプロモーターの使用は、トランスジェニックラインのより多くの多価利用することができます。 注：pPTGAL4プラスミドを使用して、GAL4（TF）の上流に前かがみ遺伝子の組織特異的発現を駆動する調節配列をクローニングすることにより、第2の構造体を取得します。 </li><li> （標準的な手順に従って）33 ワット1118ハエに別々のプラスミドを注入し、Pエレメントの挿入によってハエのゲノムに構築物を挿入します。 </li><li>二つの異なる染色体上の構築物でフライラインを回復するために、形質転換体を選択します。最終TRAPラインは一つの二重トランスジェニック安定ラインを得るために以下の2行（遺伝的交雑）を組み合わせて作成されます。 F0：W-。 CYO、UAS EGFP :: RpL10A。 MKRS / TM6BX W-; CYO / SCU;前かがみGAL4 / TM6B。 F1：W-。 CYO、UAS EGFP :: RpL10A。前かがみGAL4 / TM6B。超この行を増幅し、所望のステージの胚を収集します。 </li></ol> 2.胚コレクション<ol><li> （18万ハエ/ケージの周り）ケージあたり若いハエの約40グラムを含む8大型円筒人口ケージを準備します。 </li><li>そうハエが彼らの卵管から胚を開発クリアすることができ、その前産むと呼ばれるに進みます。そのため、固化した寒天とグレープジュースの混合物を含有する2 11センチメートル径のペトリ皿に1時間ハエを置き、新​​たに作られた酵母ペーストで表面の⅓をカバーしています。 3後グレープジュースプレートの交換は同様のたてプレート上の実胚を収集します。 注：インキュベーション時間は研究発達時間窓に応じて異なります。 </li><li>ケージからプレートを取り外して、正しい発達段階を得るために必要な時間同温度でそれらを残す（例えば、ADDITの産卵+ 10時間の3時間ionalのインキュベーションは、10〜13時間の産卵（AEL））後の段階から胚を提供します。ブラシを使用して50mlの水でプレート内容（胚、酵母ペースト、死んだハエ）を再懸濁します。 </li><li>死んだハエの胚および残りの体の部分を分離し、小径ふるい上に残った胚を収集し、次いで脱イオン水で簡単に洗浄するための篩（700ミクロン、355ミクロン、112ミクロン）のシリーズを通過します。それはふるいを詰まらせることができますようにコレクションごとに18以上のプレートを使用しないでください。 </li><li> 2分間の脱イオン水中の4.5％の漂白剤でDechorionate胚および30〜60秒間、脱イオン水で十分に洗い流してください。攪拌しながら室温で5〜10分間、PBS、0.01％トゥイーン20、100μg/ mlのシクロヘキシミドで胚を培養します。 </li><li>セルロース吸収性シートの乾燥胚およびマイクロ遠心チューブに移します。チューブの重量を測定し、液体窒素に浸漬することによって胚をフラッシュ凍結。この段階では、乾燥した胚を、-80℃で数ヶ月間保存することができます。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。 GFP抗体に結合された磁気ビーズの調製<ol><li>徹底的に穏やかに撹拌して、元の瓶の中にプロテインG磁気ビーズを再懸濁します。 </li><li>転送90 RNaseフリーのチューブにビーズμlのマグネット（30〜60秒）でそれらを収集。ビーズ90μlを60〜80 mg / mlのタンパク質を含む溶解物1mlの免疫沈降（IP）を行う必要があります。ビーズの飽和を防止するための比率を尊重。タンパク質の量に応じて、いくつかのチューブを使用してください。 </li><li> 1×PBS、0.01％トゥイーン20（500μL）でビーズを洗浄し、上清を廃棄し、磁石にビーズを収集します。ビーズに0.01％のTween 20のPBS 350μlのGFP抗体30μgのを追加し、室温で30分間混合端の上にゆっくりと端とインキュベートします。 </li><li> 、磁石（30〜60秒）にビーズを集め、上清を破棄し、ポリソーム抽出緩衝液500μlですすぐ（ヘペス10mMの、のKCl 150 mMの、のMgCl 2 5mMの、DTT、0.5mMの、トリトン1％、シクロヘキシミド100μg/ mlの広報otease 1×阻害剤、RNaseインヒビター100 U）。 </li><li>磁石にビーズを収集し、バッファ（BSA 0.1μgの/μL、酵母tRNAは0.1μg/μL、ポリソーム抽出緩衝液中のグリコーゲンは0.1μg/μl）をブロックする500μlを添加します。 </li><li>室温で30分間インキュベートし、新鮮なブロッキング緩衝液で1回、この手順を繰り返します。 </li><li>その後、ビーズを思い出すと免疫精製ステップ（セクション6）にすぐに進み、磁石にビーズを収集し、ポリソーム抽出緩衝液500μlですすぎます。 </li></ol> 4.溶解物の準備<ol><li>開始する前に、多方向高速ビーズグラインダーのプログラムを設定：2×10秒間5000rpmで、15秒のポーズで。ポリソーム抽出バッファーを含む氷の上に予備冷却15ミ​​リリットルチューブに乾燥させた胚（1.5 g）を移し、すぐにホモジナイズします。ポリソーム抽出緩衝液4ml中の胚を1.5gを均一化。 </li><li> 2で均質化された胚を広げ2 mLの試験管を予冷し、エンブリーを挽きますホモジナイザープログラムを実行して、OS。氷の上に新鮮な予冷マイクロ遠心チューブにライセートを移し、2000グラムで10分間、4℃で遠心分離して核後上清を準備します。 </li><li>氷の上に新鮮な予冷マイクロ遠心チューブに上清を移し、上澄み液（最終濃度= 0.1％）に10％のNonidet P-40の1/100サンプル容量を追加し、チューブを反転させて軽く混ぜます。 </li><li> 300mMの1,2-ジヘプタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DHPC）（最終濃度= 30mmの1/9サンプルボリュームを追加、チューブの底に液体を収集するためのパルス遠心minifugeのサンプル）、（インキュベーションの間に数回転倒混和）チューブを反転させて静かに混合し、氷上で5分間混合物をインキュベートします。 </li><li> 20,000gで10分間4℃で遠心分離することにより、ポストミトコンドリア上清を準備します。ブラッドフォード法によりタンパク質濃度を測定します：溶解液中の濃度は60〜80 mg / mlの間であるべきです。 T新鮮な新しい予冷マイクロチューブに上清AKEと前吸収工程（第5節）にすぐに進みます。 </li></ol> 5.前の吸収<ol><li>徹底的に穏やかに撹拌して磁気ビーズを再懸濁し、室温でマイクロ遠心チューブに（ビーズ/ 1ミリリットル胚溶解物の30μl）をビーズ30μlのを転送します。 </li><li> 、磁石のビーズを集め上清オフピペット、およびポリソーム抽出バッファー（500μlの）中でビーズを再懸濁します。 、磁石上にビーズを収集し、胚溶解液を追加し、回転装置上で4℃で1時間インキュベートします。 <ol><li>ビーズを除去し、免疫精製工程のために氷上で上澄みを保ちます。免疫精製前に、例えば、RT-qPCRにより、免疫精製後に回収したRNAサンプルとグローバルなRNAサンプルを比較するために、上清（入力）の100μLを保ちます。 </li></ol></li></ol> 6.免疫精製<ol><li> 1ミリリットル（60〜80 mg / mlのタンパク質に対応する）のを加えますGFP抗体に結合されたブロックされたビーズの90μLを含むRNaseフリーのチューブに、溶解物を事前に吸収しました。チューブ回転で穏やか転倒混合しながら2時間、4℃でサンプルをインキュベートします。また、4℃でのインキュベーションのO / Nを実行します。 </li><li>インキュベーション後、磁石にビーズを収集します。その後、0.5 mMの、シクロヘキシミド100μg/ mlのRNアーゼ阻害剤100 U洗浄緩衝液500μl（ヘペス10mMの、KClの350ミリメートル、のMgCl 2 5mMの、ノニデットP-40 1％、DTTで再懸濁し、ビーズをスピンダウンするminifugeを使用して、 ）と磁石の上にそれらを収集。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>新しい予冷RNaseフリーのチューブにビーズを変更し、二回洗います。磁石にビーズを収集し、ビーズに直接1ミリリットルのTRIzolを追加することにより、RNA抽出に進み、製造元の指示に従ってください。 </li></ol> 7. RNAのクリーンアップと品質評価<ol><li>製造業者の指示に従ってのRNeasyマイクロキットを使用してください。完了時に、ELUT（x）のμlのRNaseフリー水を用いて電子のRNA。 2 60℃分、-80℃で保存スナップ凍結サンプルのために暖かいです。バイオアナライザーを用いてRNAの品質をチェックします（製造元の指示に従ってください）​​。 </li><li> TRAPed RNAの特異性をテストするために、製造業者の説明書（上付き文字III）に記載の精製されたRNA（入力およびIP）の3 ngの上で逆転写反応を行います。遺伝子特異的プライマーセットを用いて、定量PCRのために得られたcDNAを使用してください。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、ショウジョウバエの胚では珍しい細胞集団の研究に専念修正翻訳リボソームのアフィニティー精製プロトコル（吹き替え「TRAP-RC &#39;）を記述します。情報は、胚の溶解およびポリソーム抽出のためのマイクロアレイまたはRNA-seqの分析、 すなわち 、1）必要な生物学的物質の量と最適化された手順に適した収率で特定のRNAの正常な分離のための重要なステップに設けられています。最適な免疫沈降のための2）ビーズ/抗体への溶解物の比率; 3）高い特異性および感度を有するTRAP-RC実験を実行するように、洗浄緩衝液組成を含むバックグラウンドの低減を可能にするステップ。 このプロトコルは、容易に任意の他の細胞型に適用作る再現可能なデータが得られます。この技術は、積極的に、mRNAの翻訳レベルで遺伝子発現差を分析し、従ってスペックでタンパク質の発現を理解する道を開くことを可能にします<html>特定の時間窓でのIFICセルタイプ。タンパク質存在量が翻訳及び分解プロセスの速度に依存することに注意してください。 TRAP法の主な制限は、正確な定量的にタンパク質含有量を測定するための、または翻訳後修飾を検出することができないことです。 mRNAの本体に沿ってリボソーム密度を測定し、そうすることで、細胞型特異的に非常に強力なツールをフットプリントリボソームと結合したTRAPを作ることができることにより、定量化を改善します。最近の論文34において、この組み合わせは、ヒト胚性腎臓293細胞で行いました。著者らは、ストレプトアビジンビーズを使用してRpL10Aの誘導ビオチン化形態の親和性精製したヌクレアーゼフットプリントを実行しました。これは、制限を目的とするために必要な生物学的物質の量であり、特定の細胞型を標的にしながら、生物全体にリボソームフットプリントを行うことが可能であるという原理の証明です。 &quot;&gt;グローバルトランスクリプトーム解析と並行してTRAP実験を行うことにより、新たに転写の間の割合を追跡することを可能にし、RNAを翻訳actively-。これは、特定の発達の状況や特定の細胞集団で行われる潜在的な転写後のメカニズム深く有益になります例えば-byマイクロRNA。 結論として、TRAPは、細胞特異的に能動的に翻訳するリボソームに結合したRNAを識別するための非常に効率的で特異的かつ高感度な方法です。この方法は、生物および組織型の多種多様に使用することができます。ここで説明する新しいTRAP-RCプロトコルは希少細胞集団（総細胞数の1％未満）および全ゲノムレベルでのその後の分析のために十分な最終材料の量のために最適化しました。 この方法の可能な制限は、コンプするのに十分な量のタグ付きリボソームを製造するための強力なドライバの必要条件であります標的細胞型における内因性タグなしのものとETE。最近の研究25では 、著者は10〜30％にタグなしリボソームに対するタグ付けの割合を推定しました。 UAS-RpL10A-EGFPのコピー数を増加させるこの問題を克服するためには、かなりこのバランスを改善するはずです。あるいは、記載の遺伝的バックグラウンドにUAS-GAL4導入遺伝子を追加するGAL4タンパク質の産生を増幅し、間接的にRpL10A-EGFPの発現を増加させます。これは、mRNA上のタグ付けされたリボソームのよりよい占有を優先すべきです。 このすでに効率的なアプローチは、より強力な、より定量的な側面を持ってたり発見し、遺伝子発現の制御のために必須である分子機構を解明するために補完的な方法を適合させることにより行うことができることに注意してください。

細胞は、開発中に特定のプロパティを取得する方法を理解することは、臓器の複雑さと病理学的状態に対するそれらの潜在的な進化を理解するために非常に重要です。 unrevealing全体的な遺伝子発現プロファイルによってセルの仕様と分化を根底遺伝子調節ネットワークを解読するための大きな研究プッシュがあり、ポルII結合状態、調節配列またはヒストンの翻訳後修飾の転写因子占有。 グローバルレベルマイクロアレイでの遺伝子発現を評価し、RNA-seqのアプローチが使用されています。マイクロアレイは、RNA-seqは、コードを含むとマイクロRNA、lncRNAsかのsnRNAのような非コードRNAのRNAの異なる種類の通知に良いギヤードであるのに対し、mRNA量を検出することを可能にします。しかしながら、これらの技術は、活発に転写、定常状態のmRNAを区別能動的mRNAの翻訳、そしてmRNAが分解プロセスに入ることができません。着実-STの測定mRNAレベルは、プロテオーム組成1-3の悪い推定であることが知られている食べました。逆に、積極的に、翻訳のmRNAを同定することはタンパク質生産のより正確な画像を提供します。 しかし、トランスクリプトーム研究は主に解釈が困難な遺伝子発現プロファイルを作成する、野生型条件4-7または解剖組織上の特定の因子の機能の損益を比較することにより、全生物レベルでつながってきました。細胞標的ツール、アフィニティ精製および感度の改善​​の最近の進歩は、現在ゲノムワイドな生体内の小さな細胞集団または単一の細胞に分析を行うことができます。 ショウジョウバエでは、トランスジェニック系統の大規模なコレクションは、細胞機能のために必要な分子機構のより正確な定量化をもたらすGAL4 / UASシステム8-10を経由して異なる組織および細胞亜集団の特定の時間的、空間的ターゲティングを可能にします。 11をキャプチャする方法として説明しました。ショ糖勾配遠心分離に基づいて、この方法は、マイクロアレイまたは深いシーケンシングで分析すると、mRNAのポリソーム画分と決意の選択はゲノムワイドな翻訳ができます。ポリソーム分離は、翻訳プロセス12の間にリボソームによって保護されたRNA断片に対応するリボソームフットプリントを識別するために、ヌクレアーゼ消化と結合することができます。リボソームフットプリントは、RNAの翻訳およびRNA配列レベルの解像度およびリボソーム位置決めの定量化の精度を増加させる、翻訳の速度を測定することができます。しかし、今日まで、それは、主としてリボソームフットプリンティングプロセスの最後に得られたRNAの収量の強い減少に、translatomesの細胞特異的単離に適用されていません。 RNAのサイズ選択は、潜在的な偽Pを生成することができることを考えるとまた、同様にRNAを保護することができ、異なるのRNPからositivesは、さらなる開発がリボソームフットプリントを改善し、細胞特異的なアプローチに適合させるために必要とされます。 このような方法の一つは、翻訳リボソーム親和性精製（TRAP）は、ハイマンらによって 2008年に記載されていると呼ばれます。マウスのニューロンのサブセットからtranslatomeを単離するために適用されます。エピトープタグ付け細胞型特異的にリボソームタンパク質をすることによって、ポリソームを選択的細胞解離および選別の手間のかかる工程を経ずに精製することができます。この場合は、リボソームの表面の60Sリボソームタンパク質L10Aは、eGFPを13でタグ付けされました。 2008年以降、いくつかの研究は、Xに 14〜19匹のマウスから、異なる種でこのメソッドを使用しています24シロイヌナズナ20,21、ゼブラフィッシュ22,23とシロイヌナズナをアフリカツメガエル 。 TRAP方法は、 ショウジョウバエモデルに適合し、プリするために使用されています神経細胞25とアストロサイト26からFY細胞型特異的mRNA。多目的バイナリGAL4 / UASシステムは、組織特異的にGFPタグ付きRpL10Aを発現するために使用しました。大人のハエの頭を配列決定した（汎神経ELAV-Gal4ドライバーによってターゲット）神経細胞および単離したRNAからポリソーム選択を実行するために解剖しました。アップレギュレートされる遺伝子の多数は、 ショウジョウバエの胚の開発に（1未満の細胞の％）現在のアプローチは、優れた特異性を有することを示す、希少細胞集団に適合させるために、私たちを促し、神経系で発現することが知られているものに相当します。 分子俳優や形態形成の動きが進化的に保存されているようショウジョウバエモデルの中では、胚段階では、発達過程の研究のための選択のモデルです。このモデルでは、これまで行っのみ組織特異的トランスクリプトームアプローチはそう細胞または核を使用して行われてきましたrtingだけハエ胚の組織/細胞特異的translatomeプロファイリング専用の方法の必要性を作成し、定常状態のトランスクリプトーム27-31を研究することができました。ここでは、 ショウジョウバエの胚に捧げ最初のトラッププロトコルを報告しています。この方法では、胚当たり約100筋細胞の非常に制限された細胞集団における従事イン翻訳mRNAは、正常に高品質と特異性で単離しました。以前に25示すように、バイナリGAL4 / UASシステムは、明らかな表現型や発育遅延、任意の毒性を伴わずに筋肉の部分集団におけるGFPタグ付きRpL10Aの発現を駆動するために使用されていません。 ショウジョウバエの胚は筋肉組織に上昇を与えるhemisegmentあたり30筋肉を持っています幼虫の。前かがみのアイデンティティ遺伝子の近くで発見された調節領域を使用することにより、30多核筋のうち6が対象としています。このアッセイでは、リボソームが翻訳伸長を使用して、mRNAの上に固定化しますシクロヘキシミドを阻害。サイトゾル抽出物は、その後、GFP抗体でコートした磁気ビーズを用いてアフィニティー精製のために使用されます。精製したRNAの品質は、バイオアナライザーを使用して検証しました。定量的逆転写PCR（RT-qPCRには）mRNA単離の特異性および感度を決定するために使用され、我々の最適化プロトコルは非常に効率的であることが実証されました。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>thermo scientific&amp;nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Purified BSA 100X&amp;nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Antibody GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td><td>75-132&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis homogenisation&amp;nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water&amp;nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM96406</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl2)&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>AM95306</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose waddin unbleached&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sieves 112, 355, 710 um&amp;nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&amp;nbsp;</td><td>28948964</td><td></td></tr><tr><td>Low binding filter tips&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1.5 ml&amp;nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Fischer Bioreagent&amp;nbsp;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

ショウジョウバエの胚の体細胞の筋システムがhemisegmentあたり30の筋肉で構成され、各筋肉は、プロパティの特定のセットを持っています。アイデンティティ遺伝子、位置、融合イベント、付着部位と神経支配の数のコード。特定の筋肉のサブセットに翻訳されたmRNAを同定することは、これらの特定の筋肉の特性を形成するために必要なタンパク質の情報を提供します。 TRAPベースの方法を使用して、同一遺伝子前かがみを発現する筋肉の亜集団からのRNAは、（ 図1A-B）で精製しました。このアプローチの主要な関心事は、単離されたRNAの品質と特異性です。ここで報告された最適化されたプロトコルは、バイオアナライザー分析を用いて評価した高品質のRNAの体系的な回復を可能にしました。得られたプロファイルは、RNA（ 図1C）の劣化を示さありません。 トラップ法を中心に開発された他の研究では、質問は、データの特異性を調達しました。ここで私はビーズまたはチューブにRNAの非特異的結合および洗浄緩衝液の最適化によって結合されたバックグラウンドを抑制するための方法をmprove。前かがみ発現細胞を単離するバックグラウンドレベルと効率を評価するために、我々は同じ胚段階の3反復のRT-qPCRの試験を主導しました。 4つの異なる遺伝子の-富化をフォールド（MEF2、前かがみ、プロスペロー、soxNeuro）はRpL32遺伝子（ 図1D）に対する入力と正規化と比較して算出しました。これらの結果は、汎筋肉遺伝子MEF2と前かがみ遺伝子の5.6倍の濃縮の2.3倍の濃縮を示しました。対照的に、神経系で表される2つの遺伝子が枯渇入力と比較しました。非常に類似した倍数変化値は、プロトコルが堅牢であることを実証し、3生物学的反復に観察されました。 150×10 ^ 6の正の（合計100 GFP細胞/胚を含んで得られた1.5×10 ^ 6胚を中心に、1.5グラムで始まる前かがみ-Gal4ドライバーを持つと細胞）。 TRAP実験を実行した後、収量は、ステージ・オブ・関心に応じて、特定のRNAの約25〜45 ngのです。この材料は、マイクロアレイ解析またはRNA-seqのライブラリーを構築するために増幅プロトコルを用いてRNA-seqのを実行するのに十分です。効率がRpL10A-EGFPを発現するために使用されるドライバの強さに強く依存します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> 図1.品質と前かがみ-GAL4&gt; UASRpL10A-EGFP胚からのTRAP-単離されたRNAの特異性評価。 （AB）hemisegment（A）ごとに6つの前かがみの筋肉細胞に特異的にRpL10A-EGFP発現を示すステージ16胚の共焦点画像。一般的な筋肉のマーカーBeta3tubulinとRpL10A-EGFPの共局在は、マージ画像（B）に観察されます。 （C）TRAPed RNA raの品質管理nはバイオアナライザー上のrRNA 18Sおよび28Sの完璧な整合性を示します。 （D）ステージ16胚の3生物学的複製のTRAP-単離されたmRNA実験の高い特異性を示す、RT-qPCR分析。倍の変化は、入力とRpL32遺伝子に対して正規に比べて計算されます。すべての筋肉系統に存在するMEF2転写物は、より制限された前かがみの転写物が5.6倍に富むあるのに対し、入力に比べて2.3倍に富むです。 プロスペローとsoxN遺伝子を発現する神経細胞が2.2倍に枯渇し、それぞれ5.5倍されています。エラーバーは標準偏差を表す（n = 3）であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.8K ビュー.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

ビデオ: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

遺伝学

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

生化学

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

発生生物学

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

生物学

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製

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ショウジョウバエ視覚系における低豊富な細胞の浄化

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

中規模の

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

ホールマウントRNAを蛍光

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する

アン in vivoで架橋アプローチショウジョウバエ胚

からのタグ付き核の親和性に基づく分離