この作品は、ピッツバーグ大学とNIHの助成金AG028977からアルフにシード資金によってサポートされていました

概要伝統的にトランスジェニックワームは、Cに導入遺伝子DNAをマイクロインジェクションすることによって生成されたelegansの生殖系列1,2,3,4。成功しながら、このアプローチは、特殊な機器やワームの解剖学とマイクロインジェクション技術と経験の開発が必要。さらに最近では遺伝子銃砲撃は生殖細胞系列5,6に外来DNAを導入するDNAでコーティングされた金粒子を使用する代替アプローチとして開発されました。このアプローチは成功するために実践の面でより短い時間投資が必要です。 Cの微粒子銃爆撃成功は、動物の大量を必要とするので、トランスジェニックワームを生成するために線虫は、個々のワームのレベルの低効率を有する。これらは、いくつかの方法で栽培が、我々は関与してプレートの作業と数を減らすために卵のプレートを使用することができます。我々のプロトコルは、卵のプレートやワームの準備から始まり、その後、バイオラッドPDS-1000/Heヘプタシステムを使用して砲撃のプロトコルに焦点を当てています。我々はBerezikovら7の仕事の一部が我々のプロトコルを適応した。 爆撃で、UNC - 119遺伝子は通常、トランスジェニック動物のためのマーカーとして使用されます。この変異を有するワームの株がひどくまとまりのないものであり、かろうじて移動、外観がみすぼらしいです、とdauer幼虫8を形成することはできません。 dauerは、不利な条件下での生殖成人に開発を遅らせるために使用されている代替の幼虫期である、とdauerへのエントリは複数の遺伝子9によって規制されています。 UNC - 119の遺伝子を持ついくつかの菌株はC.から入手できます。 elegansの遺伝学センター（CGC、ミネアポリス、ミネソタ州）。オリジナルDP38株（UNC - 119（ED3））も、下流の実験に影響を与える可能性のある関係のないdauer形成構成（DAF - c）の変異を運ぶ。いくつかのラボではこの突然変異をoutcrossedている、とHT1593株はCGCから入手可能です。我々はトランスジェニック動物は、DP38株を識別するために、いくらか簡単であることがわかるとトランスジェニック動物を作成する場合に、この菌株を使用する傾向があります。必要な場合には、我々は、DAF - C変異を削除するには、トランスジェニックワームを異系交配させるためにHT1593を使用してください。導入遺伝子を準備している間私達が成長しているプレートの在庫を維持できるようにDP38ワームが成長するために取得するプロトコル内の最も遅いステップの一つです。 対象の遺伝子と一緒にUNC - 119マーカーの発現は、正常な運動性と体の大きさ5の救助に基づいて導入遺伝子を発現する動物を簡単に識別することができます。 UNC - 119遺伝子は小さなCのためにいくつかの情報源、およびベクトルUNC - 119のゲノムDNAを使用して、UNC - 119プロモーターとcDNA、およびゲノムDNAから得ることができます。 briggsiae遺伝子は、8,10を使用している。我々は最近、相同組換え11およびトランスジェニック動物12を生成するためのCre - LOX組み換えによるUNC - 119遺伝子を運ぶためにワームのfosmidsを変更する方法により、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドにUNC - 119カセットを追加するために単純なプロトコルを説明した。プラスミドはAddgene社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から入手可能である。 単一の砲撃を行うことに伴う労力は重要ではあるが、管理している間、1日のうちに複数の砲撃を行うに関与して追加の作業は最小限に抑えられます。その結果、我々は日常的に各を生成するために必要な作業を減少させるトランスジェニックワームの生産をクラスタ化する。 1。エッグプレートの準備彼らの運動障害ではプレートの他の部分はまだ食べ物が含まれている間、板の部分に餓死する傾向があるため、UNC - 119変異体ワームは、標準のNGMプレート上で増殖することは困難です。卵のプレート上に厚い食品層がUNC - 119ワームがより簡単にクロールするとすべての板7を乗っ取ることができるように卵のプレートは、この問題を解決する。卵プレートも少ないプレートが13を必要とされるようにワームの大量の成長を支援するという利点があります。通常5卵のプレート一砲撃のためにワームを成長させるために十分である。下のレシピは約50枚になりますが、必要に応じてより少ないように半減することができます。 我々はプレート内で抗生物質や抗真菌薬の両方を使用してのみプレートをシーディングするための次亜塩素処理によって生成された卵を使うので、卵のプレートは、容易に汚染されることができる。 1日目： <ol><li> 500ミリリットル瓶でLB（400 mL）を準備する。 20分のためのオートクレーブ。 </li><li> 2％寒天を1リットルNGAを使用して、〜50 10センチメートルNGAのプレートを注ぐ。我々は200μg/ mLの13にリットルとストレプトマイシンあたりナイスタチン10 mLを加える。 </li><li> 200μg/ mlのストレプトマイシンを含むLBでOP50 - 1 40mLの一晩培養して成長する。この株は、ストレプトマイシン耐性とCGCから入手可能です。 </li><li>用500mLにボトルをオートクレーブ次の日。 </li></ol> 2日目： <ol><li>滅菌瓶に10鶏の卵の別の卵黄。我々は、卵黄のセパレータを（ターゲットを含む家庭用店舗、で入手可能）を使用します。シェイク。 </li><li> LBと400MLにボリュームをもたらす。振る</li><li> 1時間60℃でインキュベートする。 </li><li>室温まで冷却。 </li><li> OP50 - 1の40mlのを追加。振る</li><li>プレート当たりの混合物の5〜8 mLを配布する。 </li><li>プレートは室温で一晩沈殿することができます。 </li></ol> 3日目： <ol><li>静かにプレートから残留液を捨てる。室温で一晩上ふたで乾燥することができます。 </li></ol> 4日目： <ol><li>必要になるまで4℃ボックスやビニール袋や店舗° Cにプレートを置く。これらのプレートは、1〜2ヶ月のために使用するためにOKのように見える。 </li></ol> 2。種まきエッグプレート<ol><li>最近飢えプレートに集中OP50を追加することで、6センチメートルNGAプレート上DP38ワームを展開します。単一の爆​​撃のために、私たちは種子5卵のプレートに〜6小さなプレートを使用してください。複数の爆撃のために、我々は、卵のプレートを播種する前に代わりにシード2濃縮ペプトンのプレートに小さなプレートを使用してください。 </li><li>次亜塩素酸13,14の使用を介してDP38ワームから卵を隔離する。滅菌S -基底またはM9バッファ13,14の卵を再懸濁します。 </li><li>卵板の適切な数に卵を（プレートあたり&gt; 10,000）を追加します。砲撃に使用する70から10日間20 ° Cで卵のプレート上でワームが成長する。プレートは、ワームは、プレートから食べ物をクリアするために始めた後に使用できるようになります。これらのプレートは、餓死することが非常に困難ですし、長い期間のために成長すると、ワームの歩留まりが向上します。 </li></ol>砲撃我々は、事前に金の株式を用意し、それが℃で使用するために4℃で保存されてください。また、必要に応じては、気づかれていないと10cm NGAプレートをスポットされています。汚点のないプレートは事前によく注ぎ、完全にワームで追加された液体の吸収を促進するために乾燥して許可する必要があります。 砲撃の日に、我々は、DNAでコーティングされた金粒子を準備最初に起動した後、ワームを洗い流してください。私たちは、その後、気づかれていないNGAプレートにワームを追加し、金粒子を洗浄、macrocarriersに転送することを終える。 金粒子の調製： <ol><li> 1.7mLチューブに金粒子の60mgを秤量し、15分間70％エタノールに浸漬。金粒子を沈殿させるために簡単にスピン。 </li><li>滅菌水で3回洗浄し、金を集めるために簡潔にするたびにスピン。 </li><li> 50パーセント滅菌グリセロール1mLのに金を再懸濁します。これは、株式、金粒子溶液であり、4℃で数ヶ月保存することができる</li></ol>ワーム： <ol><li> S -基底またはM9バッファーと卵板オフDP38ワームをフロートし、50mLのコニカルチューブに移す。 </li><li>ワームが底になるまでベンチでチューブを保持します。その後、バッファーを吸引除去し、新鮮なS -基底またはM9を追加。バッファがゴミの比較的明確になるまで、2〜3回洗浄する。 DNAのコーティングが完了するまで、この手順でワームを保つ。 </li><li>爆撃あたりのバッファのワームの約2〜3 mLを吸引しておきます。氷上で10センチメートル気づかれていないNGAのプレートに移す。 NGAのプレートが衝突前に完全に乾燥させる必要があるので、転送量を最小限に抑えることが重要です。ワームとプレートの表面全体を覆​​うようにしてください。 </li><li>プレートは氷上で乾燥することができます。氷は、乾燥しながら凝集からワームを防ぐことができます。 </li></ol>このステップは重要です：プレートはドライでなければならず、ワームは、均等にNGAのプレート上に分散した。氷の上にワームを保つことはプレート上に移動し、山に集約することを防ぎます。 DNA調製（一爆撃用）： <ol><li> 1.7mLチューブに混ぜる。 <ul><li> 50μlの金粒子。追加する前に徹底的に再懸濁します。 </li><li> 50μlのDNA（10 - 15ug）。我々は、環状または直鎖DNAの間にほとんど差を参照してください。通常、我々は、DNA精製（キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）のためにキアゲンミディプレップカートリッジを使用してください。 </li><li> 50μlの2.5MのCaCl 2。このソリューションは、室温で数週間安定です。 </li><li> 20μlの0.1Mスペルミジン。 スペルミジンは、水溶液中で不安定である。我々は、-20℃で70μlスペルミジンのアリコートとストアを行う私たちは、その後、0.1M溶液を得るために右使用前に水1mLの追加。このソリューションは、それぞれの砲撃のために新しく調製する必要があります。 ボルテックスしながらのCaCl 2、DNAとスペルミジン/プロタミン滴ずつを追加し、我々は通常、低速で1.7mLチューブに金粒子渦と。リン酸カルシウムでトランスフェクションしている人にとっては、このテクニックはよく知られている。 我々はまた、プロタミンの代わりに非常に良い結果が15とスペルミジン使用している。我々は、水に新鮮な溶液（1mg/mL）を準備し、私たち電子50μlのではなく、スペルミジンの20μlの。我々はプロタミンを使用する場合、我々は通常、代わりに氷の上に置くの10分間室温で混合物をインキュベートする。プロタミンは、冷凍保管する必要はありませんし、粉は液体の代わりになります。 </li></ul></li><li> 30分間氷上で混合物をインキュベートし、定期的に懸濁液中の金粒子を保つために混ぜる。その後簡単に回転し、上清を吸引除去する。 </li><li> 300μl70％エタノールで洗う。簡単にスピン。 </li><li> 1mLの100％エタノールで洗浄する。簡単にスピン。 </li><li> 170μlの100％エタノールに再懸濁します。 </li></ol> macrocarriersの準備： <ol><li> 2 - プロパノール7 macrocarriers（バイオラッド、ヘラクレス、CA）をすすいでください。ティッシュペーパーの上に置き、室温でそれらを乾燥させて。 </li><li>各macrocarrierの中心にDNA /金の混合物の20μlのを追加。懸濁液中の金を維持するためにピペッティングの前に渦の右側にしてください。 </li><li>エタノールが蒸発してみましょう。 </li></ol> 3。砲撃実験は、システムを介してヘリウムをフラッシュする前に、空白の砲撃を行ってください。 <ol><li>真空ポンプと密接な真空ポンプのトラップをオンにします。我々は、オイルフリー真​​空ポンプを使用してください。 </li><li>ヘリウムタンクをオンにします。その圧力が≥2200psiかどうかをチェック。 </li><li> 2 - プロパノールのウェットラプチャーディスクは、（1350 PSI）、ヘプタアダプタのキャップを保持に配置する。 </li><li> PDS - 1000のシステムにアダプタをネジ込み、付属のトルクレンチで締めます。 </li><li>ホルダーとシート、それら提供されたツールでに7 macrocarriersを置きます。その後、ホルダーへのヘプタの停止画面と底を置く。上から二番目の棚に上のホルダーと場所を反転します。 macrocarriersの金の斑点の側は、この時点では下向きにする必要があります。 </li><li>ヘプタアダプタのコンセントを備えたmacrocarrierホルダーの上部の穴を合わせます。 </li><li>衝撃チャンバー内で最も低い棚の上のワーム（蓋のオフ）でコーティングされたNGAのプレートを置きます。 </li><li>完全にPDS - 1000で真空流量のノブを開きます。チャンバーは、水銀を26に達するまでVACボタンを押してください。その後、真空を維持するために位置を保持するために切り替えます。 </li><li>ディスクが破裂するまで、発射ボタンを押したままにします。圧力が1350psiに達したときに発生します。時々これが発生する50〜20秒かかります。ボタンを離します。 </li><li>チャンバー（排気口の位置）から真空を解放し、プレートを取り外します。 </li><li>真空とヘリウムをオフにします。 </li><li>ラインはヘリウムを（ヘリウムゲージが0 psiをマークする）が含まれていないまで、数回起動。 </li><li> PDS - 1000システムの電源を切ります。 </li></ol>爆撃後のワームの回復： <ol><li> ℃で20分間20℃で砲撃プレートにしておきます。 </li><li> 10mLのS -基底またはM9バッファーでプレートからワームをフロートさせます。 </li><li> 10センチメートル斑点NGAプレート - 20に0.5mLをワームを置く。 </li><li>救出ワームをチェックする前に20℃で約2週間° Cまたは室温（22〜24 ° C）を残す。 </li><li>解剖顕微鏡でUNC - 119（+）の表現型を持つワームの画面。救出ワームが非救出ワーム以上生存の優位性を持っているので、プレートが飢えている後にスクリーニングするための最適な時間です​​。 </li><li>救出ワームが含まれている各10cmのプレートから一個の行を生成します。 </li></ol> 4。代表的な結果トランスジェニック動物を得ることに関して持つプロトコルの成功は、特定の遺伝子に依存する。プロモーターの場合：GFPレポータートランスジーン私たちは20行まで取得している。より多くの典型的な結果は3-10行です。アップトランスジェニック系統の30％に統合された行ですが、これはランダムで、統合されたラインが特に望まれている場合我々は一日に複数の爆撃を実行します。

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利害の衝突は宣言されません。

微粒子銃砲撃はC.を含む、多くの生物に外来DNAを導入する簡単な方法です。 エレガンス 1,5,6,7,16。それは、CaCl 2の存在下でDNAと複合体を形成する金粒子に依存しています。このようなスペルミジンなどのカチオン性ポリアミンは、生体内のヌクレアーゼ分解からDNAを保護する。スペルミジンは不安定な分子なので、-20℃で小分けに格納し、右側の爆撃を実行する?...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

自由生活線虫C.を使用して多数の研究所虫は急速に増加している。この生物学的モデルの人気は急速な世代時間と短い寿命、簡単かつ安価な保守、完全に配列ゲノム、およびRNAiリソースおよび変異動物の配列に起因する。 C.のさらに、分析エレガンスのゲノムは、ワームの研究は、全体のマウスや培養細胞で行われた研究に重要な補助であることを示唆しているワームや高等脊椎動物の間に大きな類似性を、明らかにした。ワームの研究の強力かつ重要な部分は、遺伝子の局在性と機能を研究するトランスジェニック動物を使用する機能です。トランスジェニック動物は、ワームの生殖細胞のマイクロインジェクションを介して、または微粒子銃砲撃の利用を通じて作成することができます。砲撃は、新しい技術であり、ラボの数にはあまり馴染みがあります。ここでは、Bio - Rad社製PDS - 1000システムを使用して金粒子と微粒子銃爆撃によりトランスジェニックワームを生成する単純なプロトコルを記述する。両性生殖細胞へのDNAのマイクロインジェクションと比較して、このプロトコルは、ワームの解剖学的構造を識別したり、マイクロインジェクションを行うことに関して持つオペレータからの特別なスキルを必要としないという利点があります。さらに、複数のトランスジェニック系統は、通常、単一の爆撃から取得されます。また、マイクロインジェクションとは対照的に、微粒子銃爆撃は体外アレイと統合された導入遺伝子の両方でトランスジェニック動物を生成します。統合されたトランスジェニック系統を取得する機能は、外来DNAを統合する変異原性プロトコルの使用を避けることができます。結論では、微粒子銃爆撃、特にマイクロインジェクションで熟練になるために必要な時間と労力を投資に興味のない研究者のために、トランスジェニック動物の生成のための魅力的な方法になります。

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

トランスジェニックワームは一般的に使用されています<em&gt; C.エレガンス</em&gt;研究。説明するには、DNAでコーティングされた金粒子と微粒子銃砲撃を使用してワームに導入遺伝子を導入するために、効果的な、まだ、単純なプロトコルです。労力と砲撃の結果は、トランスジェニック動物の生成のためのマイクロインジェクションに匹敵する。

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K ビュー.  University of Pittsburgh. トランスジェニックワームは一般的に使用されています C.エレガンス研究。説明するには、DNAでコーティングされた金粒子と微粒子銃砲撃を使用してワームに導入遺伝子を導入するために、効果的な、まだ、単純なプロトコルです。労力と砲撃の結果は、トランスジェニック動物の生成のためのマイクロインジェクションに匹敵する。

ビデオ: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

C. elegansのシナプス伝達の変異体の薬理学的特性評価のためのパラダイム

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

培養胚のための方法<em&gt; C.虫</em&gt;細胞

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

培養<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em &gt;微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.