この方法は、生体内細胞内顕微鏡を使用して、生きた動物の好中球移動中の膜リモデリングを研究する技術を示しています。このプロトコルは、物理的条件下での動物移動中の膜ダイナミクスを研究し、組織の微小環境に関与しないようにするための独自のアプローチを提供します。この技術は、膜リモデリングと細胞骨格の動的臓器再配置、およびさまざまな細胞タイプおよび遊走細胞における膜輸送に対処するように調整できます。
まず、野生型マウスから精製した好中球懸濁液に緑色蛍光色素を1.5ミリリットルのBSAコーティングチューブで加えます。チューブローテーター内で穏やかに攪拌し、室温で30分間インキュベートします。HBSSを使用して3回洗浄した後、室温でGの400倍で5分間遠心分離し、ペレットを1ミリリットルのハンクスバランス塩溶液に再懸濁します。
この懸濁液をBSAコーティングされたチューブに入れ、注入手順まで穏やかに攪拌しながらチューブローテーターに入れます。注射の前に、細胞ペレットを生理食塩水に再懸濁して、20マイクロリットルあたり200万〜500万個の細胞の密度に達します。麻酔をかけた動物を摂氏37度の温熱パッドに移し、体温を維持します。
足の引き抜き反射をテストした後、画像品質を最適化するために、細かいトリマーを使用して耳から毛を取り除きます。動物を横向きに置き、耳の端を持ち、サージカルテープを使用して加温パッドに沿って平らにしてから、33ゲージの針を備えた注射器に好中球懸濁液を充填し、マイクロマニピュレーターに取り付けます。針を耳に向かってゆっくりと動かし、ゆっくりと皮膚に穴を開けます。
針が皮膚の内側に入ったら、ピストンをゆっくりと押し、2〜3マイクロリットルの細胞懸濁液を供給します。耳の2〜3つの異なる領域に注射を慎重に繰り返した後、手術用テープを慎重にはがし、監視下で動物が意識を取り戻すのを待ちます。イメージングの前に動物を1時間休ませて、組織と細胞が注射手順から回復するのを待ちます。
顕微鏡の電源がオンになっていて、ステージとレンズが摂氏37度に予熱されていることを確認してから、麻酔をかけた動物を顕微鏡ステージに置きます。ステージの穴をガラスのカバースリップで覆います。麻酔をかけた動物を慎重にステージに移動します。
イメージングが1時間以上計画されている場合は、眼科用軟膏を塗布し、翼のある注入ベースの灌流システムを固定します。.カバーガラスの中央に生理食塩水を一滴垂らし、その上に注入した好中球の耳を置きます。カバースリップの中央を横切る滅菌綿棒を使用して耳をそっと平らにし、エアポケットを取り外します。
動物の頭に近い耳の側面に木の棒をそっと押し付け、テープでロックして耳を固定します。次に、顕微鏡の接眼レンズを使用して関心のある領域を見つけ、多光子取得モードに切り替えます。レーザー励起波長を900〜930ナノメートルに設定すると、緑色蛍光色素、mTomato、およびコラーゲン-Iを同時に取得できます。
次に、放出された光を収集するために、検出器に適切なミラーとフィルターの組み合わせを設定します。ハードウェア構成に最も適した設定を決定します。移動細胞を30秒から1分間隔で追跡できる場合でも、少なくとも10秒未満の間隔で細胞内イベントを画像化します。
従来の生体内顕微鏡法では、30倍レンズと画像サイズ512×512ピクセルのガルボスキャナーを使用して細胞移動を追跡し、宿主マウス組織を調査し、ステップサイズ2マイクロメートルの電動ステージを使用してZ軸の変位を設定し、30秒ごとに30マイクロメートルの深さのボリュームをイメージングできるようにします。生体内細胞内顕微鏡法では、40倍レンズと3倍平均化の共鳴スキャナーを使用して、高ダイナミックな膜リモデリングをより高い倍率と解像度でイメージングします。また、1マイクロメートルのステップサイズのピエゾを使用してZ軸の変位を設定し、4〜5秒ごとに20マイクロメートルの深さのボリュームイメージングを可能にします。
高出力励起レーザーを20 x 20マイクロメートルの狭い領域に10秒間集束させることにより、好中球の移動を引き起こす滅菌レーザー損傷を誘発します。レーザー誘発性損傷は、すべてのチャネルに現れる強力な自己蛍光シグナルと、その結果生じるコラーゲン配列の変化によって特定されます。実験の最後にデータを保存して、さらに分析できるようにします。
レシピエントマウスは、生体内顕微鏡を用いたアプローチにより、血管、常在細胞、毛包などの耳組織の構造的特徴を可視化することを可能にしました。レーザー誘発性の損傷は、すべてのチャネルで検出される強力な自家蛍光と、コラーゲン配列の変化により、容易に視覚化できました。皮膚の3次元構造と注入された好中球の局在の全体像は、外層から内層までの皮膚のZスタックを3次元ボリュームレンダリングで描写します。
タイムラプスイメージングは、好中球が耳の皮膚をサンプリングし、細胞内マトリックスおよび宿主組織と相互作用することを示しました。生体内細胞内顕微鏡を用いて、遊走中の原形質膜の動的リモデリング、前縁での膜突起の形成、細胞後部の後部の収縮を鮮明に可視化します。タイムラプスシーケンスは、細胞内マトリックスとの相互作用の複雑さを明らかにします。
細胞膜の局所的なダイナミクスは、細胞表面の下にある100の境界点の同定に基づくアルゴリズムパイプラインを使用して分析されました。局所的な曲率の変化と原形質膜突起によって強調された領域は、境界点ごとに計算され、キモグラフとして各時間枠で報告されました。細胞の前面と背面の両方が、細胞の側面よりも高い曲率を維持します。
負の領域変化は、正の領域の変化がより顕著である前縁よりも、セルの後部でより顕著です。イメージング後、組織を採取、固定、染色のために処理することで、目的のターゲットをさらに評価し、メカニズムを解明することができます。膜ダイナミクスを画像化するように設計されたこの手順は、さまざまな細胞タイプやそれぞれの環境で移動する細胞におけるより広範な細胞生物学の問題に対処するように調整できます。
