このプロトコルは、マウスから一次メラノサイトおよび線維芽細胞培養を生成する迅速かつ簡単な方法を記述する。この技術は表皮と真皮が分離される必要がないので、最小限のトレーニングで迅速かつ一貫して行うことができます。この方法は、皮膚メラノサイトおよび線維芽細胞生物学を研究するために使用することができる。
これらの培養物の実験は、癌、創傷治癒、および色素沈着欠陥に関連する洞察を提供することができる。始める前に、必要な試薬をすべて準備し、水浴の温度を確認してください。複数のサンプルを処理する場合は、表 1 の試薬スケーリングガイドを参照してください。
この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるブランドン・マーフィーです。層流キャビネットでは、70%エタノールを含む滅菌ペトリ皿の中で各安楽死マウスのトランクを短時間ロールする。エタノールからマウスを取り出し、空の滅菌ペトリ皿に入れます。
次に、手術用ハサミを70%エタノールで殺菌する。これらのはさみを使用して、首から尾まで続けて、体幹の腹側の皮膚に切開を行います。滅菌鉗子を使用して、マウスの幹から皮膚を剥がし、皮膚の真皮側から余分な脂肪組織を取り除く。
皮膚を真皮側を下に置き、3ミリリットルの1倍の抗生物質抗ミキ酢溶液を含む6つの井戸皿に入れます。室温で2~3分間インキュベートします。次に、組織チョッパーをオンにし、ここに示したものに設定を調整します。
ティッシュチョッパーブレードを取り付ける際や、機械を操作する際には、必ず注意してください。皮膚を真皮側に下に移し、滅菌組織チョッパー皿に移し、組織チョッパーを完全に通します。この後、均質化された皮膚を3ミリリットルの皮膚消化バッファーを含む滅菌15ミリリットル円錐管に移す。
P1000マイクロピペットを使用して、10〜15回激しく上下にピペットで得られた懸濁液を混合する。円錐形のチューブをキャップし、37°Cの水浴でサンプルを15分間インキュベートし、3〜5分ごとにチューブを反転させます。次に、チューブを室温で750倍Gのスイングバケットローターに5分間遠心し、皮膚ホモジネート中の細胞をペレットする。
P1000マイクロピペットを使用して、ペレットを乱さないよう注意して、皮膚消化バッファーをゆっくりと完全に除去します。すべての皮膚消化バッファーを吸引してください。問題が発生した場合は、メラノサイト培地を2~3ミルで細胞ペレットを洗浄し、遠心分離を繰り返し、余分な皮膚消化バッファーを除去します。
その後、P1000ピペットで15〜20回上下にピペットを入れてメラノサイト培地の1ミリリットルで細胞ペレットを徹底的に再懸濁する。得られた細胞溶液を、メラノサイト培地1ミリリットルを含む6つのウェル皿でコーティングされていないウェルに下降させます。メッキされた皮膚を37°Cの組織培養インキュベーターで40分間5%の二酸化炭素でホモジュネートインキュベートする。
この後、コーティングされていない皿から6つのよく使う皿をコーティングした前に洗われたコラーゲンの1つの井戸に培養上清を移す。G-418を培地に加え、最終濃度は1ミリリットル当たり100ナノグラムとなる。接着性線維芽細胞を含む未コーティング皿の1つの井戸に2ミリリットルの線維芽細胞培地を加えます。
5%の二酸化炭素を摂氏37度で組織培養インキュベーターで一晩両方の培養をインキュベートする。16〜24時間の培養後、各培養物から培地及び残骸を別途吸引する。各皿を1回のPBSで2回洗います。
次に、メラノサイト培養物に2ミリリットルの新鮮なメラノサイト培地を添加し、繊維芽細胞培養物に2ミリリットルの新鮮な線維芽細胞培地を添加する。本研究では、線維芽細胞とメラノサイトの培養物が同じ皮膚サンプルから同時に生成される。均質化された皮膚が最初にめっきされるとき、媒体は曇って現れる。
しかし、インキュベーション後、より大きな細胞コングロマリットおよび付着細胞線維芽細胞が皿中に見えるようになる。培養から非接着細胞は、コラーゲン被覆皿に移され、G-418で処理される。G-418によって殺された線維芽細胞は、次の5日間、メラノサイト培養培地に浮遊しているのが見られる。
培養で4〜5日後、メッキされたメラノサイトは、メラノサイト顆粒で樹状表現型を取り始める。この表現型は過ぎ去ると持続し、汚染された角化細胞のクラスターは失われる。得られたメラノサイトおよび線維芽細胞培養物の純度は、フローサイトメトリーを用いて確認される。
メラノサイトマーカーGP100の発現はメラノサイト培養物に特異的であり、一方、線維芽細胞マーカーFSP1は原発線維芽細胞のみに見られる。C59ケラチノサイト細胞は、ケラチノサイトマーカーK14に陽性染色する唯一の培養物である。濃縮されたメラノサイト培養の確立にかかる時間を決定するために、追加の分析が行われます。
GP100陽性細胞は、培養で10日後に4日目に出現し、ピークを迎え始める。この手順は、様々なインビトロおよび高スループットオミックアッセイ用のメラノサイトおよび線維芽細胞培養物を迅速に生成するために使用することができる。
